Fisiología y Genética de Actinomycetes

Resumen

El laboratorio de Fisiología y Genética de Actinomycetes lleva adelante diversas líneas de trabajo relacionadas con: 1) la utilización de técnicas de ingeniería genética, ingeniería metabólica y biología sintética para la producción de nuevas moléculas lipídicas con novedosas propiedades físicoquímicas utilizando Escherichia coli como plataforma de producción; 2) el estudio de la regulación de la homeostasis lipídica en el patógeno Mycobacterium tuberculosis y la identificación de nuevos blancos terapéuticos en esta bacteria, como así también la búsqueda de nuevos compuestos con actividad antimicobacteriana; 3) la identificación de cepas de Streptomyces para su uso como agentes de biocontrol. Todos estos proyectos son abordados desde un punto de vista multidisciplinario y en colaboración con otros investigadores del IBR, como así también con prestigiosos investigadores nacionales e internacionales.

Líneas de Investigación

Rol de la homeostasis lipídica en la patogenicidad de Mycobacterium tuberculosis: validación de nuevos blancos e identificación de nuevos compuestos antimicobacterianos

Mycobacterium tuberculosis, el agente etiológico de la tuberculosis (TB) en humanos, continúa siendo un grave problema para la salud mundial. Los ácidos micólicos (AM), uno de los más importantes lípidos de la membrana externa de las micobacterias están asociados a la virulencia bacteriana y a su resistencia intrínseca a los antibióticos; siendo su ruta biosintética uno de los principales blancos para el tratamiento de la TB. La biosíntesis de los AM involucra dos sistemas distintos de sintasa de ácidos grasos, FAS I y FAS-II, que trabajan de manera coordinada para mantener la homeostasis lipídica estrictamente regulada. El objetivo de esta línea de trabajo es entender cómo las micobacterias ejercen un estricto control en la biosíntesis de los lípidos de membrana e identificar los componentes clave de la red que controla la biosíntesis de ácidos grasos y AM a nivel bioquímico y transcripcional utilizando un enfoque multidisciplinario. Una mejor comprensión de este complejo proceso de regulación en la síntesis de lípidos en micobacterias contribuirá en gran medida al desarrollo de nuevas estrategias para controlar esta enfermedad, incluyendo el diseño o la identificación de compuestos que podrían desregular la biosíntesis de ácidos grasos e inducir la muerte bacteriana.
Responsables Dres. Gabriela Gago, Lautaro Diacovich y Hugo Gramajo.

Caracterización de la relevancia fisiológica de la enzima FabH y de la síntesis de fosfolípidos en la coordinación de la síntesis de la envoltura de Mycobacterium tuberculosis durante la infección

El objetivo general de esta línea es aportar información acerca de los mecanismos que permiten a M. tuberculosis adaptar la expresión de los componentes de su envoltura celular en respuesta a los cambios ambientales encontrados en el huésped. La hipótesis de trabajo es que la regulación coordinada de los diferentes sistemas de biosíntesis de lípidos sería fundamental para la viabilidad y adaptación del metabolismo de M. tuberculosis durante la infección. Uno de los objetivos que nos proponemos es caracterizar el rol fisiológico de FabH en M. tuberculosis durante la infección, enzima clave para la conexión entre los dos sistemas FAS y necesaria para la síntesis de ácidos micólicos. Asimismo, las vías de síntesis de fosfolípidos y TAGs están coordinadas presentando enzimas y sustratos comunes, que también dependen del sistema FAS I; siendo el ácido fosfatídico (PA) un intermediario clave en las dos rutas metabólicas. En micobacterias, y en Actinomycetes en general, aún no se han caracterizado las aciltransferasas involucradas en la síntesis de PA y por lo tanto nos proponemos también elucidar estos pasos enzimáticos esenciales para la biosíntesis de las membranas. El análisis de los resultados obtenidos proveerá herramientas que permitan entender cómo se coordina la síntesis de lípidos en M. tuberculosis y su rol durante la infección y podría brindar nuevos blancos para el diseño de nuevos compuestos antimicobacterianos. Responsable: Dra Gabriela Gago.

Estudio del metabolismo de nitrógeno y el carbono en micobacterias

M. tuberculosis posee 6 putativos complejos acil-CoA carboxilasa (ACCasa), algunos de los cuales son esenciales y han sido estudiados a nivel bioquímico. Sin embargo, poco se conoce acerca de la regulación de estas enzimas. Recientemente, se han identificado dos proteínas que interaccionan con una subunidad de complejos ACCasa; una proteína pertenece a la familia de proteínas de tipo PII, mientras que la otra es un ortólogo de DivIVA, denominada Wag31.
En micobacterias y otros actinomicetes la modulación de la actividad ACCasa mediada por proteínas PII y Wag31 no ha sido previamente estudiada. Nos proponemos entonces como objetivo caracterizar la interacción de las proteínas PII y Wag31 con los complejos ACCasas en micobacterias, a nivel bioquímico y su implicancia en la fisiología de este patógeno, analizando asimismo la relación entre el metabolismo del N y el C. Los resultados permitirán esclarecer procesos moleculares que podrían afectar la fisiología de este grupo de baterías. Responsables: Dres. Lautaro Diacovich y Hugo Gramajo.

Desarrollo de plataformas bacterianas para la producción de oleoquímicos con nuevas propiedades fisicoquímicas

A fin de reemplazar algunos derivados petroquímicos por moléculas menos contaminantes, se desarrollaron estrategias para la producción de nuevos compuestos oleoquímicos. Al presente, la mayor parte de los oleoquímicos que se producen son de origen vegetal, sin embargo, en los últimos años se comenzó a utilizar a los microorganismos como “biorefinerías” para la producción de moléculas lipídicas de uso industrial que van desde esteres, aclcholes, alcanos hasta ácidos grasos (AG) con propiedades especiales. En referencia a los compuestos derivados de AG, es importante resaltar que las propiedades físicoquímicas, y por lo tanto el uso de estos compuestos, está definido en gran medida por las características estructurales de los AG que lo forman. En este sentido los AG insaturados, si bien mejoran la fluidez de los compuestos, los mismos son fácilmente oxidables. Por otro lado, los AG saturados, si bien son resistentes a la oxidación, presentan bajos rendimientos y perfomance a bajas temperaturas. Con el fin de obtener AG, y derivados de los mismos, con mayor impedimento estérico para mejorar su fluidez a bajas temperaturas, pero manteniendo su estabilidad, nuestra propuesta es producir AG metil-ramificados en bacterias. Para ello desarrollaremos una plataforma basada en E. coli capaz de sintetizar estos compuestos alterando su proceso natural de síntesis de AG expresando nuevas rutas metabólicas obtenidas de distintos Actinomycetes.
Responsables: Ana Arabolaza y Hugo Gramajo.

Estudios bioquímicos y genéticos sobre mecanismos de activación de ácidos grasos en Actinomycetes

La propuesta central de esta línea de trabajo consiste en elucidar la relevancia de los mecanismos de activación de ácidos grasos (AG) en actinomycetes. La reacción de activación de AG más extendida implica la conversión de los mismos a sus correspondientes derivados de la coenzima A (CoASH), la cual es catalizada por una familia de enzimas omnipresentes: las FACL. Sin embargo, en actinomycetes y en varios microorganismos patógenos como Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae, existe un mecanismo alternativo donde los AG pueden convertirse en acil-ACP. Las enzimas encargadas de este paso son FAAS que convierten los AG en aciladenilatos los cuales luego acilan al portador de acilo: proteínas ACP o dominios ACP en policétido sintasas para biosintetizar, por ejemplo, metabolitos secundarios o lípidos complejos. Así, las FAAS representan un importante punto de coordinación entre el metabolismo primario y secundario en actinomycetes. Además, algunos miembros de esta gran familia, particularmente las FAAL (Fatty Acyl-AMP Ligasas) han sido validados como blanco para el desarrollo de nuevos antimicobacterianos. Actualmente no es factible discriminar entre enzimas FAAS y FACL por estudios basados en sus secuencias proteicas, siendo necesario una validación bioquímica para distinguirlas. Es por esto que proponemos realizar estudios genéticos y bioquímicos para caracterizar el rol fisiológico de algunos candidatos seleccionados de este tipo de enzimas. Responsable: Ana Arabolaza.

Producción de productos naturales por Actinobacterias

Las bacterias del grupo de los Actinomycetes han provisto más de dos tercios de los productos naturales de uso terapéutico, siendo el 80% de estos compuestos producidos por bacterias del género Streptomyces. En esta línea de investigación, estamos enfocados en búsqueda de nuevos compuestos con propiedades biológicas de interés terapéutico. Estamos llevando adelante distintas “Estrategias bioguiadas para la identificación de nuevos agentes antimicrobianos”. Por un lado, estamos analizando la identificación de compuestos antifúngicos producidos por bacterias rizosféricas para su utilización en tratamientos de semillas. Por otro lado, y en colaboración con la Dra. Eleonora Garcia Véscovi y la Dra. Leticia Llarull estamos realizando una búsqueda de compuestos naturales de cepas de Streptomyces que tengan actividad moduladora sobre distintos sistemas de dos componentes de Salmonella typhimurium y Staphylococcus aureus involucrados en la virulencia o patogenicidad de dichas bacterias. Responsable: Dr. Eduardo Rodríguez.

Desarrollo de Actinobacterias como agentes de biocontrol

En esta línea de investigación abordamos el problema en la merma que se origina en la producción agrícola como es el caso del cultivo de soja, debido al estrés biótico originado por distintos hongos fitopatógenos. En la actualidad para controlar estas enfermedades se aplican fungicidas químicos previo a la siembra. Sin embargo, su uso está cada vez más restringido y discutido, debido a los efectos tóxicos y nocivos para la salud humana y el medio ambiente. Una alternativa al uso de los curasemillas, surgió el tratamiento con microrganismos que inducen un efecto protector sobre los cultivos o biocontrol. En este proyecto buscamos el desarrollo de agentes de biocontrol en base a cepas de Streptomyces aisladas de rizósfera de plantas de soja. Estas cepas fueron caracterizadas por sus propiedades para inhibir hongos fitopatógenos como también promotoras del crecimiento de los cultivos. Actualmente no encontramos profundizando los conocimientos de los mecanismos de control biológico y promoción del crecimiento por parte de estas cepas, como también estudiando la importancia de la producción de compuestos antifúngicos en el biocontrol. Por otro lado, se busca optimizar la producción y formulación de las mismas con la intención de reemplazar a los curasemillas tradicionales y así reducir el impacto ambiental del uso de los mismos. Estos estudios los llevamos adelante con la colaboración de la Dra. M. Amalia Chiesa del IICAR. Responsable: Dr. E. Rodríguez.

Publicaciones Seleccionadas

  • Escherichia coli coculture for de novo production of esters derived of methyl-branched alcohols and multi-methyl branched fatty acids. Microb Cell Fact. 15; 110. Bracalente F, Sabatini M, Arabolaza A, Gramajo H. (2022). doi: 10.1186/s12934-022-01737-0.
  • Streptomyces eurocidicus promotes soybean growth and protects it from fungal infections. Biological Control.Volume 165. Barbara Bercovich, David L. Villafañe, Julieta S. Bianchi, Camila Taddia, Hugo Gramajo, María Amalia Chiesa, Eduardo Rodríguez. (2022). doi.org/10.1016/j.biocontrol.2021.104821.
  • FasR regulates fatty acid biosynthesis and is essential for virulence of Mycobacterium tuberculosis. Frontiers in Microbiology. 11, 124- 132.  Sonia Mondino, Cristina L. Vázquez, Matías Cabruja1, Claudia Sala, Amaury Cazenave-Gassiot, Federico C. Blanco, Markus R. Wenk, Fabiana Bigi, Stewart T. Cole, Hugo Gramajo and Gabriela Gago (2020).  doi: 10.3389/fmicb.2020.586285.
  • Mycobacterium tuberculosis FasR senses long fatty acyl-CoA through a tunnel and a hydrophobic transmission spine. Nature Comm. 11, 3703. Julia Lara, Lautaro Diacovich, Felipe Trajtenberg, Nicole Larrieux, Emilio L. Malchiodi, Marisa M. Fernandez, Gabriela Gago, Hugo Gramajo & Alejandro Buschiazzo. (2020). doi.org/10.1038/s41467-020-17504-x.
  • Development of a cyanobacterial heterologous polyketide production platform. Metab Eng. 49, 94-104. Roulet J, Taton A, Golden JW, Arabolaza A, Burkart MD, Gramajo H. (2018). doi: 10.1016/j.ymben. 2018.07.013.
  • Biochemical characterization of the minimal domains of an iterative eukaryotic polyketide synthase. FEBS J. 285, 4494-4511. Sabatini M, Comba S, Altabe S, Recio-Balsells AI, Labadie GR, Takano E, Gramajo H, Arabolaza A. (2018). doi: 10.1111/febs.14675.
  • A novel multidomain acyl-CoA carboxylase in Saccharopolyspora erythraea provides malonyl-CoA for de novo fatty acid biosynthesis. Sci Rep. 30; 6725. Livieri AL, Navone L, Marcellin E, Gramajo H, Rodriguez E. (2028). doi: 10.1038/s41598-019-43223-5.
  • Role of long-chain acyl-CoAs in the regulation of mycolic acid biosynthesis in mycobacteria. Open Biology. 7, 170087. Yi Ting Tsai, Valentina Salzman, Matías Cabruja, Gabriela Gago and Hugo Gramajo. (2017). http://dx.doi.org/10.1098/rsob.170087.
  • The infectious intracellular lifestyle of Salmonella enterica relies on the adaptation to nutritional conditions within the Salmonella-containing vacuole. Virulence.  9, 1-18. Diacovich L, Lorenzi L, Tomassetti M, Méresse S, Gramajo H. (2016). doi: 10.1080/21505594.2016.1270493.
  • Expanding the chemical diversity of natural esters by engineering a polyketide-derived pathway into Escherichia coli. Metab Eng. 24, 97-106. Menendez-Bravo S, Comba S, Sabatini M, Arabolaza A, Gramajo H. (2014). doi: 10.1016/j.ymben.2014.05.002.

Patentes

Engineered organisms for production of novel lipids.  Hugo Gramajo, Ana Arabolaza, Santiago Comba, Simón Menéndez-Bravo, Hector Alvarez. US10,119,145 B2. 21-11-2018
Engineering polyketide synthase in cyanobacteria. Julia Roulet, Arnaud Taton, James W Golden, Ana Arabolaza, Michael D Burkart, Hugo Gramajo. Patent Application Number USA: 16833249, International Application Number: 5570,  27 de Mayo de 2020.