Fisiología y Genética de Actinomycetes

Resumen

Nuestro laboratorio tiene tres grandes áreas de interés, dos de ellas relacionadas con el metabolismo lipídico en bacterias y la tercera relacionada con la producción de nuevos compuestos antibacterianos o antiparasitarios. Los ácidos grasos cumplen un rol fisiológico fundamental, sirviendo como una importante fuente de energía metabólica, como precursores básicos en la biosíntesis de fosfolípidos y como determinantes cruciales en la integridad y función de las membranas biológicas. Por consiguiente uno de nuestros principales objetivos es estudiar el metabolismo de lípidos y su regulación en bacterias patógenas como ser Mycobacterium y Salmonella. Éste conocimiento será utilizado para identificar nuevos blancos de drogas y nuevos compuestos antibacterianos que puedan ser utilizados para el tratamiento de las infecciones causadas por estos géneros bacterianos. El estudio del metabolismo lipídico en bacterias del género Streptomyces está orientado hacia un área de interés biotecnológica; en éste sentido los conocimientos generados se utilizarán para optimizar estos organismos mediante ingeniería metabólica y convertirlos en una plataforma para la producción de biocombustibles (triacilglicéridos y micro-biodiesel). Otra área de interés es la optimización de la producción de compuestos naturales de interés farmacológico en Streptomyces y en Escherichia coli, como así también la generación de nuevos compuestos mediante ingeniería genética combinatoria.

Líneas de Investigación

Regulación del metabolismo lipídico en Streptomyces

En todos los organismos vivos los ácidos grasos cumplen un rol fisiológico fundamental, sirviendo como una importante fuente de energía metabólica, como precursores básicos en la biosíntesis de fosfolípidos y como determinantes cruciales en la integridad y función de las membranas biológicas. Debido al rol esencial que tienen estas moléculas en la fisiología celular y los complejos procesos que gobiernan, su síntesis y degradación deben ser finamente reguladas a fin de permitir mantener una composición estable de las membranas biológicas. Por otra parte, el estudio del metabolismo de lípidos y su regulación ha cobrado nuevo interés, no solo desde el aspecto básico sino también por la obtención de precursores necesarios para la producción de biocombustibles. Streptomyces presenta un complejo metabolismo lipídico; ya que muchos de los miembros de este grupo de microorganismos tienen la capacidad de sintetizar metabolitos secundarios (utilizados ampliamente en la industria como, antibióticos, antiparasitarios, inmunosupresores, anticancerígenos) cuya síntesis requiere de los mismos precursores que la síntesis de ácidos grasos. Además, tienen la capacidad intrínseca de acumular triglicéridos, el cual representa un destino alternativo para los ácidos grasos producidos. Como objetivo general de este proyecto nos propusimos estudiar los mecanismos genéticos y bioquímicos que regulan el metabolismo de lípidos en la bacteria oleaginosa S. coelicolor. Para ello planteamos los siguientes objetivos específicos: a) caracterizar los factores transcripcionales que controlan la síntesis y degradación de ácidos grasos y determinar las señales a las que responderían dichos reguladores; b) identificar y estudiar los genes involucrados en la degradación de ácidos grasos; c) identificar y caracterizar la enzima fosfatidato fosfatasa cuyo rol es producir el diacilglicerol para la síntesis de triglicéridos.A largo plazo, se podrá utilizar estos conocimientos para modificar genéticamente este microorganismo (ingeniería metabólica) y así mejorar la producción de triglicéridos con el fin de utilizar estas grasas neutras como biocombustibles; alternativamente, se podría modificar las rutas biosintéticas que llevan a la acumulación de triglicéridos y redirigir el posible excedente de ácidos grasos para la producción de “microbiocombustibles”.

Regulación de la homeostasis lipídica en micobacteria

Mycobacterium tuberculosis, el agente etiológico de la tuberculosis (TB) en seres humanos, continúa siendo un grave problema para la salud mundial. Los ácidos micólicos, uno de los más importantes lípidos de la membrana externa de las micobacterias, están estrechamente asociados a la virulencia bacteriana y a su resistencia intrínseca a los antibióticos; siendo su ruta biosintética uno de los principales blancos para el tratamiento de la tuberculosis. La biosíntesis de los ácidos micólicos involucra dos sistemas distintos de sintasa de ácidos grasos, FAS I y FAS-II, que deben trabajar de manera coordinada para mantener la homeostasis en la síntesis de lípidos estrictamente regulada. El objetivo principal de este proyecto es entender cómo las micobacterias ejercen este control en la biosíntesis de los lípidos de su membrana y descubrir los componentes clave de la red de regulación que controla la biosíntesis de ácidos grasos y de ácidos micólicos a nivel transcripcional. Para alcanzar estos objetivos nos proponemos utilizar un enfoque multidisciplinario que incluye el análisis genético de cepas mutantes condicionales, tanto en Mycobacterium smegmatis y M. tuberculosis, la identificación y caracterización de las señales metabólicas que son sensadas por las proteínas reguladoras implicadas en esta red de regulación mediante el uso de técnicas bioquímicas y espectroscópicas, y, finalmente, la determinación de la estructura de los factores de transcripción por cristalografía de rayos X. Una mejor comprensión de este complejo proceso de regulación de la homeostasis en la síntesis de lípidos en micobacterias contribuirá en gran medida al desarrollo de nuevas estrategias para controlar esta enfermedad, incluyendo el diseño o la identificación de compuestos que podrían desregular la biosíntesis de ácidos grasos e inducir la muerte bacteriana.

Producción de productos naturales por Actinomycetes

Las bacterias del grupo de los Actinomycetes han provisto más del 45% de todos los productos naturales de uso terapéutico, siendo el 80% de estos compuestos producidos por bacterias del género Streptomyces. El objetivo general de este proyecto es la búsqueda de nuevos compuestos con propiedades biológicas de interés terapéutico. Una estrategia empleada para generar variaciones estructurales en los productos naturales es la manipulación de rutas de biosíntesis de los mismos con el fin de alterar el patrón de glicosilación. En este proyecto estamos usando esta estrategia, para generar nuevos derivados de antibióticos de tipo macrólidos como la eritromicina y azitromicina por medio de modificaciones por agregado de aminoazúcares. Estas modificaciones le otorgan mejores propiedades antiparasitarias contra Plasmodium falciparum. Actualmente se estan realizando estudios sobre la relación estructura-actividad de estos compuestos y los posibles blanco de acción del los mismos. Los policetónicos son un grupo importante de productos naturales, los cuales se sintetizan de manera similar a los ácidos grasos mediante condensaciones sucesivas de unidades de ácidos carboxílicos de cadena corta como acetil-CoA. Además, el acetil-CoA sirve de nexo entre la glicólisis y el ciclo de Krebs generando dadores de electrones para la respiración y precursores de aminoácidos para las estructuras celulares. Por lo tanto, en Streptomyces el acetil-CoA es un metabolito clave en la interacción entre el metabolismo primario y secundario. Es por esto que el objetivo para esta parte es estudiar las rutas metabólicas implicadas en el metabolismo del acetil-CoA, en la interacción entre la glicólisis y el ciclo de Krebs en Streptomyces, y el efecto de las mismas sobre la disponibilidad de este precursor para la síntesis de antibióticos policetónicos, ácidos grasos y triacilglicéridos de gran interés biotecnológico. La realización de este proyecto ampliará los conocimientos sobre diferentes aspectos del metabolismo de Streptomyces y su influencia en la producción de metabolitos secundarios, permitiendo en un futuro, elaborar un diseño racional con el fin de aumentar la producción de compuestos de interés terapéutico.

Caracterización del metabolismo lipídico durante la infección por Salmonella

Salmonella es un patógeno intracelular capaz de infectar un amplio rango de animales, causando enfermedades como enteritis y fiebre tifoidea. Recientemente, los problemas relacionados con Salmonella se han incrementado tanto en términos de incidencia como en severidad. La emergencia de cepas resistentes a multidrogas, como fluoroquinolonas y cefalosporinas de tercer generación, resulta en una severa limitación del tratamiento efectivo en humanos. Salmonella usa dos sistemas de secreción de tipo III para inyectar proteínas efectoras directamente en la célula hospedadora, que le permiten promover la infección y la enfermedad. La virulencia de este patógeno reside en su habilidad para establecer un nicho replicativo dentro del hospedador, denominado vacuola que contiene Salmonella (SCV, Salmonella-containing vacuole), que se genera por la acción coordinada de proteínas eucariotas moduladas por efectores secretados por Salmonella. El microambiente de la SCV y la bacteria, y las rutas metabólicas requeridas durante la infección no están definidos. Nuestro objetivo es desarrollar sondas biológicas denominadas “biosensores” cuya expresión es modulada por el medioambiente y el estado fisiológico de la bacteria. Las sondas concebidas para monitorear los perfiles de expresión de los genes involucrados en la biosíntesis o degradación de lípidos, reflejarán el metabolismo adaptativo utilizado por Salmonella durante el proceso de infección.

Publicaciones Seleccionadas

  • Rodriguez E, Navone L, Casati P, Gramajo H. (2012) Impact of Malic Enzymes on Antibiotic and Triacylglycerol Production in Streptomyces coelicolor. Appl Environ Microbiol. [Epub ahead of print]
  • Asención Diez MD, Peirú S, Demonte AM, Gramajo H, Iglesias AA. (2012) Characterization of recombinant UDP- and ADP-glucose pyrophosphorylases and glycogen synthase to elucidate glucose-1-phosphate partitioning into oligo- and polysaccharides in Streptomyces coelicolor. J Bacteriol. 194(6):1485-93.
  • Gago G, Diacovich L, Arabolaza A, Tsai SC, Gramajo H. (2011) Fatty acid biosynthesis in actinomycetes. FEMS Microbiol Rev. 35(3):475-97.
  • Salzman, V., Mondino, S., Sala, C., Cole, S.T., Gago, G., and Gramajo, H. (2010).Transcriptional regulation of lipid homeostasis in mycobacteria. Mol Microbiol. 78, 64-77.
  • Arabolaza, A., D'Angelo, M., Comba, S. and Gramajo, H. (2010). FasR, a novel class of transcriptional regulator, governs the activation of fatty acid biosynthesis genes in Streptomyces coelicolor. Mol Microbiol. 78, 47-63.
  • Peirú, S., Rodríguez, E., Tran, C., Carney, J. and Gramajo, H. (2007). Characterization of the heterodimeric MegBIIa:MegBIIb aldo-keto reductase involved in the biosynthesis of L-mycarose from Micromonospora megalomicea. Biochemistry. 46, 8100-8109.
  • Lin, T., Melgar, M., Kurth, D., Swamidass, S., Purdon, J.,Tseng, T., Gago, G., Baldi, P., Gramajo, H. and Tsai, S. (2006). Structure-based inhibitor design of AccD5 an essential acyl-CoA carboxylase carboxyltransferase domain of Mycobacterium tuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. 103, 3072-3077.
  • Diacovich, L. Peirú, S., Kurth, D., Rodríguez, E., Podestá, F., Khosla, C. and Gramajo, H. (2002). Kinetic and Structural Analysis of a New Group of Acyl-CoA Carboxylases found in Streptomyces coelicolor A3(2). J. Biol. Chem. 277, 31228-31236.
  • Pfeifer, B., Admiral, S., Gramajo, H., Cane, D. and Khosla, C. (2001). Biosynthesis of complex polyketides in a metabolically engineered strain of E. coli. Science 291,1790-1792.

Colaboradores

  • Dr. Sheryl Tsai: UC Irvine (USA).
  • Dr. Stewart Cole: Global Health Institute, EPFL, Lausanne, Switzerland.
  • Dr. Annaik Quemard: Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale, CNRS, Toulouse, France.
  • Dr. Dean C. Goodman: Plant Cell Biology Research Centre, University of Melbourne, Australia.
  • Dr. Guillermo Labadie: División Química Orgánica del Instituto de Química de Rosario, IQUIR-CONICET, UNR, Argentina.

Subsidios

  • Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica.
  • NIH
  • CONICET
  • Perez-Guerrero Trust Fund

Director

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Gramajo, Hugo
Sede CCT
Email: gramajo@ibr-conicet.gov.ar
Tel: +54 341 4237070
Oficina Int: 642
Laboratorio Int: 623

Investigadores

  • Ana Arabolaza
  • Lautaro Diacovich
  • Gabriela Gago
  • Eduardo Rodríguez

Becarios Post-Doctorales

  • Bernardo Bazet Lyonnet
  • Santiago Comba
  • Simón Menendez Bravo

Becarios Doctorales

  • Matías E. Cabruja
  • María Julia Lara
  • Julia Roulet
  • Martín Sabatini
  • Yi Ting Tsai
  • Barbara Bercovich
  • Agostina Crotta Asis
  • Andrea Livieri

Tesinistas

  • Julián A. Paganini
  • Delfina Ensinck
  • Mauro Tomassetti