Estructura, plegamiento y función de proteínas

Resumen

Nuestro grupo estudia dos grandes grupos de proteínas: los chaperones moleculares y las flavoenzimas, analizando las relaciones entre sus estructuras y funciones, como así también sus posibles inserciones metabólica en determinados organismos. Estas proteínas se encuentran ampliamente distribuidas y cumplen funciones relevantes en procesos fisiológicos normales y durante condiciones de estrés en todos los organismos vivos.

Nos interesan especialmente aquellos procesos que le permiten a estas proteínas cumplir sus roles eficientemente:  el reconocimiento de sustratos, la regulación de sus actividades por el entorno y/o por otras proteínas, su interacción con otras macromoléculas, sus mecanismos catalíticos y la obtención de altas eficiencias funcionales.
Nuestro acercamiento experimental incluye el estudio de organelas aisladas y el análisis de enzimas recombinantes salvajes y modificadas por ingeniería genética. Utilizamos como modelos enzymas provenientes de arroz, arveja, Arabidopsis thaliana y Leptospira  interrogans, como así también de manera comparativa la de otras plantas y bacterias.

Líneas de Investigación

Estudio de las relaciones estructura-función de flavoenzimas

Uno de nuestros modelos de trabajo es la flavoenzima ferredoxina (flavodoxina)-NADP+ reductasa (FNR). Esta enzima posee la capacidad de catalizar reacciones que involucran transportadores obligatorios de uno o dos electrones. Esto probablemente justifica su amplia distribución y su participación en muchos procesos de transferencia electrónica. Se han identificado y caracterizado FNRs en cloroplastos, en bacterias, en mitocondrias de animales y de levaduras y en apicoplastos de parásitos intracelulares obligados. Participa en metabolismos tan diversos como la hidroxilación de esteroides, la reducción de nitrato, la fijación de nitrógeno e hidrógeno, la asimilación de piruvato, la desaturación de ácidos grasos, la síntesis de aminoácidos y desoxirribonucleótidos, y en la protección del estrés oxidativo en células procariotas y eucariotas. Paralelamente a esta importancia metabólica, debe mencionarse que la FNR de organismos fotosintéticos es una de las etapas limitantes del proceso y se ha convertido en modelo de una gran familia estructural de características definidas.
Múltiples aspectos de estas enzimas permanecen aún desconocidos. Nuestros estudios se dirigen a comprender el mecanismo catalítico de la FNR de plantas y bacterias, y de aquellos procesos metabólicos relevantes en los que participa, con especial énfasis en las características estructurales que definen la eficiencia catalítica de estas enzimas. Específicamente estudiamos: 1) las bases estructurales que generan la alta eficiencia catalítica en las FNRs tipo plastídicas, las cuales poseen capacidades entre 100 y 200 veces mayores que sus contrapartes bacterianas, a pesar de las similitudes estructurales observadas; 2) el mecanismo molecular del proceso catalítico de estas flavoenzimas; 3) la inserción funcional de estas FNRs tipo plastídicas de alta eficiencia catalítica en el metabolismo de organismos patógenos como Leptospira interrogans, al igual que el Toxoplasma gondii y el Plasmodium falciparum, mediante el análisis estructural y funcional de esta enzima (Figura 1) y la identificación y caracterización de sus sustratos naturales.
Nuestro acercamiento experimental incluye el análisis de enzimas recombinantes salvajes y modificadas por ingeniería de proteínas, tanto de plantas, de Leptospira interrogans y de bacterias (Escherichia coli y Xantomonas axonopodis). Las enzimas son estudiadas mediante análisis cinéticos, métodos biofísicos y estructurales, como así también mediante modelización de las estructuras y sus sustratos (Figura 2). También nos hemos dedicado a analizar aquellos acercamientos matemáticos que permiten evaluar la verdadera eficiencia de una enzima posibilitando así comparaciones prácticas entre diferentes formas o variantes.

Estudio de las relaciones estructura-función de chaperones moleculares

La importación de proteínas, la biogénesis de estructuras y la homeostasis proteica de organelas son procesos de extraordinaria importancia para la vida celular, tanto en condiciones normales como en aquellas que involucran estrés o reconversiones funcionales del tejido, como por ejemplo durante los procesos de maduración de frutos. La mayoría de las proteínas de plástidos están codificadas por genes nucleares y son sintetizadas en ribosomas citosólicos como precursores de mayor tamaño. Luego de ser importadas a la organela, sus péptidos tránsito son removidos proteolíticamente y la parte madura se pliega con la asistencia de chaperones moleculares. Por otro lado, durante los procesos de maduración de frutos, de desarrollo normal de la planta y de condiciones de estrés, ocurre una enorme reconversión proteica, especialmente en cloroplastos, en gran parte mediante proteólisis. En estos mecanismos esenciales para la vida de la planta participan chaperones moleculares. Entre estos se encuentra la familia de Hsp100/Clp, que pueden actuar tanto en forma libre o asociarse a un complejo con actividad peptidasa. Así, proteínas desnaturalizadas de forma irreversible serían reconocidas por las Hsp100 y canalizadas al complejo peptidolítico para su completa degradación. Mecanismos similares permitirían la participación de Clps en la importación de proteínas a organelas.
Nuestro interés abarca el estudio de los chaperones moleculares del tipo Hsp100 de organelas de plantas a nivel estructural y funcional. Analizamos su participación en el proceso de importación de polipéptidos, en el plegamiento de proteínas y en los procesos proteolíticos en condiciones normales y de estrés. Dentro de nuestros objetivos específicos se encuentran la caracterización funcional y estructural de los chaperones ClpC1, ClpC2 y ClpD de Arabidopsis thaliana, las proteínas del complejo proteolítico ClpR2, ClpP3 y ClpP4 y las proteínas accesorias ClpT1, ClpT2 y ClpS . Estudiamos la interacción de estos chaperones con péptidos tránsito cloroplásticos salvajes y mutados, lo cual permite comprender su participación en procesos de importación de polipéptidos y degradación de precursores remanentes (Figura 3). Estos proyectos se desarrollan mediante la expresión transgénica de estas proteínas, la generación de mutantes de Arabidopsis thaliana, y estudios biofísicos y cinéticos de los chaperones puros. También se realizan experimentos de importación de polipéptidos in vitro de precursores proteicos cloroplásticos o de fusiones conteniendo GFP, a cloroplastos aislados obtenidos de plantas salvajes o de plantas deficientes en chaperones del tipo Hsp100.

Publicaciones Seleccionadas

  • Colombo, C. V., Ceccarelli, E. A. and Rosano, G. L. (2014). Characterization of the accessory protein ClpT1 from Arabidopsis thaliana: Oligomerization status and interaction with Hsp100 chaperones. BMC Plant Biology14 (1), 228
  • Sanchez-Azqueta, A., Catalano-Dupuy, D. L.; López-Rivero, A.; Tondo, M. L.; Orellano, E. G.; Ceccarelli, E. A. and Medina, M. (2014). Dynamics of the active site architecture in plant-type Ferredoxin-NADP+ reductases catalytic complexes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics 1837(10): 1730-1738.
  • Soldano, A., Yao, H., Rivera, M., Ceccarelli, E. A. and Catalano-Dupuy, D. L. (2014). Heme-Iron Utilization by Leptospirainterrogans Requires a Heme Oxygenase and a Plastidic-Type Ferredoxin-NADP+ Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects 1840(11): 3208-3217.
  • Rosano GL and Ceccarelli EA (2014) Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Front. Microbiol.5:172. doi: 10.3389/fmicb.2014.00172.
  • Catalano-Dupuy DL, López-Rivero A, Soldano A, Ceccarelli EA. (2013) Redox proteins as targets for drugs development against pathogens. Curr Pharm Des., 19, 2594-605.
  • Sánchez-Azqueta A, Musumeci MA, Martínez-Júlvez M, Ceccarelli EA, Medina M. (2012) Structural backgrounds for the formation of a catalytically competent complex with NADP(H) during hydride transfer in ferredoxin-NADP(+) reductases. Biochim Biophys Acta. 1817, 1063-71.
  • Rosano G. L, Bruch E. M, Colombo, C. V. Ceccarelli E. A. (2012) Towards a unified model of the action of CLP/HSP100 chaperones in chloroplasts. Plant Signaling & Behavior, 7, 672-674.
  • Bruch EM, Rosano GL, Ceccarelli EA. (2012) Chloroplastic Hsp100 chaperones ClpC2 and ClpD interact in vitro with a transit peptide only when it is located at the N-terminus of a protein. BMC Plant Biol. doi: 10.1186/1471-2229-12-57.
  • Catalano-Dupuy D.L., Musumeci M.A., López-Rivero A., Ceccarelli E.A. (2011) A highly stable plastidic-type ferredoxin-NADP(H) reductase in the pathogenic bacterium Leptospira interrogans. PLoS One, 6: e26736. doi:10.1371/journal.pone.0026736.
  • Tondo M.L., Musumeci M.A., Delprato M.L., Ceccarelli E.A., Orellano E.G. (2011) Structural-functional characterization and physiological significance of ferredoxin-NADP+ reductase from Xanthomonas axonopodis pv. citri. PLoS One, 6(11):e27124.
  • Rosano G. L, Bruch E. M, Ceccarelli E. A. (2011) Insights into the CLP/HSP100 chaperone system from chloroplasts of Arabidopsis thaliana. J Biol Chem., 286, 29671-80.
  • Musumeci, M. A., Botti, H., Buschiazzo, A. and Ceccarelli, E. A. (2011) Swapping FAD Binding Motifs Between Plastidic and Bacterial Ferredoxin-NADP(H) Reductases. Biochemistry, 50, 2111-2122
  • Carrillo, N., Ceccarelli E. A., Roveri O. A. (2010) Usefulness of Kinetic Enzyme Parameters in Biotechnological Practice. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews, 27, 367-382.
  • Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. (2009) Rare codon content affects the solubility of recombinant proteins in a codon bias-adjusted Escherichia coli strain. Microbial Cell Factories, 8:41
  • Paladini, D., Musumeci, M. A., Carrillo, N., Ceccarelli, E. A. (2009) Induced-Fit And Equilibrium Dynamics for High Catalytic Efficiency in Ferredoxin-NADP(H) Reductases. Biochemistry, 48, 5760-5768.
  • Musumeci, M. A., Arakaki, A. K., Rial, D. V., Catalano-Dupuy, D. L., Ceccarelli, E. A. (2008). Modulation of the enzymatic efficiency of ferredoxin-NADP(H) reductase by the amino acid volume around the catalytic site. FEBS J., 275, 1350-1366.
  • Ceccarelli, E.A., Carrillo, N., Roveri, O. A. (2008) Efficiency function for comparing catalytic competence. Trends Biotechnol., 26, 117-118.
  • Nascimento, A. S., Catalano-Dupuy, D. L., Bernardes A., de Oliveira Neto., Santos, M.A., Ceccarelli, E. A., Polikarpov, I. (2007) Crystal Structures of Leptospira interrogans FAD-containing Ferredoxin-NADP+ Reductase and its complex with NADP+ . BMC. Struct. Biol., 7, 69.

Subsidios

  •  Proyecto de investigación conjunta “Mecanismos catalíticos en flavoenzimas: clave para su utilización biotecnológica o terapéutica”. Entidad financiadora: Ministerio de Ciencia e Innovación de España. Entidades participantes: Universidad de Zaragoza – IBR. Investigadora responsable: Prof. Dra. Milagros Medina, U. de Zaragoza, España.
  • PICT 2015-2955, ANPCYT, Mincyt, Argentina. “Proteostasis en cloroplastos de plantas. Regulación y especificidad del sistema Clp."
  • PIP CONICET 2012 Nro. 112-020120100345, del Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas, “Estructura y función de chaperones moleculares y flavoenzimas”.
  • PICT 2012 Nro. 1841, ANPCYT, Mincyt, Argentina. “Estudio de la ferredoxina-NADP reductasa altamente eficiente de Leptospira interrogans. Elucidación de su/s rol/es en el metabolismo del patógeno”·
  • Cooperación Internacional CONICET-NSF, con la Universidad de Kansas, Resolución 993/13 “The heme oxygenase of Leptospira interrogans: structural basis for its catalytic mechanism”.
  • Proyecto de investigación conjunta “Mecanismos catalíticos en flavoenzimas: clave para su utilización biotecnológica o terapéutica. BIO2010-14983”. Entidad financiadora: Ministerio de Ciencia e Innovación de España. Entidades participantes: Universidad de Zaragoza – IBR. Desde octubre, 2010 hasta octubre, 2013. Investigadora responsable: Prof. Dra. Milagros Medina, U. de Zaragoza, España.

Director

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Ceccarelli, Eduardo A.
Sede CCT
Email: ceccarelli@ibr-conicet.gov.ar
Tel: +54 341 4237070
Oficina Int: 640
Laboratorio Int: 612

Investigadores

  • Daniela Catalano Dupuy
  • Germán Rosano

Becarios Post-Doctorales

  • Cecilia Balaban
  • Clara Victoria Colombo
  • Lucia Porrini

Becarios Doctorales

  • Paula Monchietti
  • Dianela Aguilar
  • Ivana Parcerisa

Tesinistas

  • Alejo Cantoia
  • Virginia Cointry

Imágenes