Biología del Estrés en Plantas

Resumen

En nuestro laboratorio investigamos los mecanismos de tolerancia en plantas frente a situaciones ambientales adversas, incluyendo estrés biótico y abiótico. Estos desafíos ambientales presentan como elemento común la imposición de un estrés oxidativo secundario debido a perturbaciones en la homeostasis redox, especialmente en cloroplastos. Con el propósito de intentar restablecer las condiciones redox mediante manipulación genética de componentes de la cadena fotosintética de transporte electrónico, hemos obtenido plantas transgénicas con tolerancia múltiple a diferentes fuentes de estrés ambiental (sequía, salinidad, alta irradiación, herbicidas y microorganismos patógenos)

Líneas de Investigación

Diseño y caracterización de plantas transgénicas con tolerancia generalizada a estrés ambiental (de origen biótico, abiótico y xenobiótico) mediante manipulación de procesos redox en cloroplastos

Cuando son expuestas a condiciones ambientales o nutricionales adversas, las plantas sufren un desbalance de la homeostasis redox en diversos compartimentos celulares, en particular en los cloroplastos, que tienen un transporte de electrones muy activo debido a la fotosíntesis. Las hipótesis centrales de este proyecto son: i) la mayor parte del desbalance ocurre en el lado reductor del fotosistema I por inactivación de ferredoxina y/o ferredoxina-NADP(H) reductasa, y puede ser corregido mediante sobreexpresión de tales componentes, ii) las estrategias sustitutivas presentes en microorganismos fotosintéticos (v. g., reemplazo de ferredoxina por flavodoxina en condiciones de estrés ambiental o deficiencia de hierro) son aún funcionales en plantas, a pesar de haber desaparecido durante la evolución de éstas, por lo que el desbalance electrónico puede ser también corregido mediante expresión de transportadores electrónicos alternativos de origen bacteriano. Los objetivos generales son: i) comprender los mecanismos de disipación de la presión electrónica en el lado reductor del fotosistema I durante episodios de estrés, y ii) diseñar plantas transgénicas modelo (tabaco, Arabidopsis) y de interés agronómico (papa, tomate) con tolerancia generalizada a situaciones de estrés ambiental (sequía, heladas, patógenos, oxidantes químicos) y a la deficiencia de hierro. Se espera, como resultado final del proyecto, construir un modelo que integre los flujos de electrones en el cloroplasto, a partir de la cadena fotosintética y conectándose con la producción de especies reactivas de oxígeno, su control y su actividad como mensajeros para las respuestas adaptativas a desafíos ambientales y/o nutricionales. En base a este conocimiento, y a las observaciones realizadas en el curso del proyecto, se espera también poder elaborar protocolos para el diseño racional de cultivos transgénicos con tolerancia aumentada a estrés ambiental.

 

Rol de las especies reactivas del oxígeno generadas en cloroplasto durante el desarrollo y la senescencia foliar

Diferentes factores adversos (sequía, salinidad, temperaturas extremas y deficiencia de hierro) pueden conducir a la senescencia delas plantas, una secuencia genéticamente programada de cambios bioquímicos y fisiológicos. La característica más distintiva de la senescencia en hojas es la pérdida de la actividad fotosintética junto con la degradación concomitante de clorofila, que da lugar al amarillamiento de las hojas. Estos procesos de degradación ocurren de manera ordenada, comenzando en el cloroplasto y resultan en un aumento de la producción de especies reactivas de oxígeno (EROS), lo cual sumado a la pérdida de la capacidad antioxidante foliar durante la senescencia, resulta en estrés oxidativo. El estrés oxidativo es inducido también transitoriamente en hojas emergentes, ya que todavía los mecanismos de fotoprotección no son totalmente operativos. Hasta el momento, no es posible establecer patrones comunes o diferenciales de los efectos del estrés fotooxidativo sobre la expresión génica en hojas emergentes y senescentes.

En nuestro laboratorio, se ha demostrado que la introducción del gen de una flavodoxina (Fld) cianobacteriana en plantas y su acumulación en cloroplastos confiere tolerancia aumentada a diversas fuentes de estrés ambiental (sequía, altas temperaturas, radiación UV, deficiencia de hierro, etc.), previniendo la acumulación de EROS y facilitando la distribución electrónica a vías productivas de cloroplastos. Fld es también capaz de retrasar la senescencia de nódulos de alfalfa cuando ésta se expresa en bacterioides. En el presente proyecto se pretende utilizar las plantas que expresan Fld como herramienta para estudiar el rol que cumplen las EROS generadas específicamente en cloroplastos en el desarrollo temprano de las hojas y durante la senescencia, caracterizando ambos procesos a nivel fenotípico, fisiológico, bioquímico y molecular.

 

Diseño de un biosensor no invasivo para detectar niveles de NADP+/NADPH en células vegetales

Diferentes cambios redox intracelulares modulan las principales transiciones en todos los organismos vivientes, incluyendo nutrición, proliferación, defensa, senescencia y muerte programada. En plantas existen al menos tres sistemas redox fundamentales: tiol-disulfuro, ascorbato y piridín nucleótidos, además del rol desempeñado por las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno. Es por lo tanto de vital importancia contar con herramientas metodológicas no invasivas capaces de estimar los niveles y estado redox de estos sistemas in vivo, así como determinar su distribución espacio-temporal de una manera dinámica. Los métodos disponibles proporcionan datos muy precarios en este sentido, pero el desarrollo de biosensores sensibles al estado redox ha modificado dramáticamente esta situación. En este proyecto se propone la creación de una sonda genéticamente codificada específica para NADP(H) mediante el diseño de un producto de fusión entre la secuencia de la enzima cloroplásticatiorredoxina C reductasa dependiente de NADP(H) con la secuencia que codifica para la proteína fluorescente sensible al estado redoxroGFP2. El producto resultante será dirigido a plástidos, citosol y mitocondrias de plantas salvajes de tabaco y líneas transgénicas que presentan distintos niveles de tolerancia a estrés ambiental. La detección de los niveles NADP+ /NADPH y su potencial redoxin vivo permitirá estudiar la relación entre distribución electrónica y tolerancia a estrés, con vistas a comprender un mecanismo fundamental de regulación biológica y manipularlo con fines agronómicos.

Desarrollo de plantas transgénicas con tolerancia aumentada a estrés ambiental por expresión deproteínas de flavina-dihierrocianobacterianas en cloroplastos

Desde el punto de vista agronómico, el estrés ambiental y su inevitable consecuencia, el estrés oxidativo, representan el factor individual más importante que limita el rendimiento de las cosechas. Estudios realizados sobre los 8 cultivos más importantes a escala planetaria muestran que el rendimiento promedio es apenas 20-40% del rendimiento óptimo, indicando que existe amplio margen para incrementar la producción de alimentos sin aumentar la superficie cultivada. Esta es una cuestión estratégica en nuestro país, teniendo en cuenta el perfil agroindustrial del mismo, y el presente proyecto se inserta en ese contexto. El objetivo es generar plantas transgénicas con tolerancia aumentada a estrés ambiental mediante la expresión de proteínas de flavina-dihierro (Flvs 1 a 4) de origen cianobacteriano. Estas proteínas actúan protegiendo la fotosíntesis en cianobacterias y algas, pero se encuentran ausentes en plantas. Estudios realizados en la cianobacteriaSynechocystis indican que existen cuatro isoformas diferentes que actuarían invivo como heterodímeros (Flv1-3 y Flv2-4), si bien pueden funcionar como homodímeros in vitro. Todas las combinaciones desarrollan actividad de reducción de oxígeno previniendo el estrés oxidativo en las proximidades del aparato fotosintético, que se genera bajo condiciones ambientales adversas. Durante el desarrollo del proyecto se diseñarán líneas transgénicas estables de tabaco y Arabidopsis expresando los genes que codifican por diferentes Flvs de Synechocystis, individualmente y de a pares (Flv1-Flv3 y Flv2-Flv4), y se analizará el desarrollo y crecimiento de las respectivas transformantes, así como la tolerancia exhibida frente a oxidantes y distintas fuentes de estrés ambiental. En particular se ensayarán sequía, exceso de irradiación y salinidad. El uso de genes de origen cianobacteriano constituye una aproximación original a una cuestión de gran relevancia agronómica.

Publicaciones Seleccionadas

  • Lodeyro, A.F., Giró, M. Poli, H.O., Betucci, G., Cortadi, A., Ferri, A.M., Carrillo, N. “Suppression of reactive oxygen species accumulation in chloroplasts prevents leaf damage but not growth arrest in salt-stressed tobacco plants” (2016) PLOS One (enprensa).
  • Pierella Karlusich, J.J., Ceccoli, R.D., Graña, M., Romero, H., Carrillo, N.“Environmental selection pressures related to iron utilization areinvolved in the loss of the flavodoxin gene from the plant genome”. (2015)Genome Biology and Evolution 7: 750-767.
  • Foresi, N.*; Mayta, M.*; Lodeyro, A.; Scuffi, D.; Correa-Aragunde, N.; García-Mata, C.; Casalongué, C.; Carillo, N.; Lamattina, L. “Expression of the tetrahydrofolate-dependent nitric oxide synthase from the green alga Ostreococcustauri increases tolerance to abiotic stresses and influences stomatal development in Arabidopsis”. (2015) Plant J.82: 806-821, doi: 10.1111/tpj.12852 (*igualcontribución).
  • Delprato, M.L., Krapp, A.R., Carrillo N. “Green Light to Plant Responses to Pathogens: the Role of Chloroplast Light-Dependent Signaling in Biotic Stress”. (2015) Photochemistry and Photobiology, 91: 1004-1011, DOI: 10.1111/php.12466.
  • Cabello*, J., Lodeyro*, A.F.,Zurbriggen, M. “Novel perspectives for the engineering of abiotic stress tolerance in plants”. (2014) Curr. Op. Biotech. 26: 62–70. (*igualcontribución).
  • Pierella Karlusich, J.J., Lodeyro, A. F., Carrillo, N. “The long goodbye: the rise and fall of flavodoxin during plant evolution”. (2014) J. Exp. Bot.68: 5161-5178.
  • Moyano, A.J., Tobares, R.A., Rizzi, Y.S., Krapp A.R., Mondotte, J.A, Bocco, J.L. Saleh, M.C., Carrillo N., Smania, A.M. “A long-chain flavodoxin protects Pseudomonas aeruginosa from oxidative stress and host bacterial clearance”. (2013) PLOS Genetics, 10(2): e1004163. doi:10.1371/journal.pgen.1004163.
  • Ceccoli, R.D., Blanco, N.E. Segretin, M.E., Melzer, M.,Hanke, M.T.,Scheibe, R.,Hajirezaei, M.R., Bravo-Almonacid, F.F., Carrillo,N. “Flavodoxin displays dose-dependent effects on photosynthesis and stress tolerance when expressed in transgenic tobacco plants”.(2012) Planta 236: 1447-1458.
  • Chorostecki, U., Crosa, V., Lodeyro, A.F., Bologna, N., Martin, A., Carrillo, N.,Schommer, C.,Palatnik,J.P. “Identification of new microRNA-regulated genes by conserved targeting in plant species”. (2012) Nucleic Acids Res. 40: 8893-8904.
  • Lodeyro, A.F.,Ceccoli, R.D.,PierellaKarlusich, J.J, Carrillo, N.“The importance of flavodoxin for environmental stress tolerance in photosynthetic microorganisms and transgenic plants. Mechanism, evolution and biotechnologicalpotential”. (2012) FEBS Lett. 31: 2917-2924.
  • Ceccoli, R.D., Blanco, N.E., Medina, M., Carrillo, N. “Stress response of transgenic tobacco plants expressing a cyanobacterialferredoxin in chloroplasts”. (2011) Plant Mol. Biol. 76: 535-544.
  • Krapp, A.R., Humbert, M., Carrillo, N. “ThesoxRS response of Escherichia coli can be induced in the absence of oxidative stress and oxygen by modulation of NADPH content”. (2011) Microbiology 157: 957-965.
  • Blanco, N.E., Ceccoli, R.D., Segretin, M.E., Poli, H., Voss, I., Melzer, M., Bravo-Almonacid, F.F, Scheibe, R., Hajirezaei, M.R., Carrillo, N. Cyanobacterialflavodoxin complements ferredoxin deficiency in knocked-down transgenic tobacco plants.(2011) Plant J. 65: 922-935.

Colaboradores

  • Dra. Andrea Smania, CIQUIBIC, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina.
  • Dr. Lorenzo Lamattina, IIB, Universidad Nacional de Mar del Plata, Argentina
  • Dr. Juan José Guiamet, INFIVE, Universidad Nacional de La Plata, Argentina.
  • Dr. Fernando Bravo-Almonacid, INGEBI, Universidad de Buenos Aires, Argentina.
  • Dr. Nico von Wirén, Dr. MohammadHajirezaei, Dr. Michael Melzer, IPK Gatersleben, Alemania.
  • Dra. Renate Scheibe, University of Osnabrück, Alemania.
  • Dr. Héctor Romero, Departamento de Ecología y Evolución, Facultad de Ciencias/CURE, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.
  • Dr. Martín Graña, Unidad de Bioinformática, Institut Pasteur Montevideo, Uruguay.

Patentes

  • Carrillo, N., Giró, M., Lodeyro, A.F., Zurbriggen, M.D. (2010) Stress tolerant plants, U S. patent WO2011/018662 A1.
  • Ceccarelli, E.A., Sosa, G., Carrillo, N., Useglio, M., Lagorio, S. (2008) Un método para el control de malezas en cultivos vegetales. Argentina Nº de registro: 80101113.
  • Tognetti, V., Palatnik, J., Fillat, M., Valle, E., Carrillo, N. (2004) Stress tolerant plants. EU patent Nº 02801941.2-2405-GB0204612.
  • Palatnik, J., Fillat, M., Carrillo, N., Valle, E., Tognetti, V. (2004) Stress tolerant plants. US patent Nº 6,781,034 B2.

Subsidios

  • PICT 2015-3828. ANPCyT. “Desarrollo de plantas transgénicas con tolerancia aumentada a estrés ambiental por expresión de proteínas de flavina-dihierrocianobacterianas en cloroplastos” Director: Dr. Néstor Carrillo
  • PICT 2014-2496. ANPCyT. “Rol de las especies reactivas del oxígeno generadas en cloroplasto durante el desarrollo y la senescencia foliar” Directora: Dra.AnabellaLodeyro
  • PICT 2012-2851. ANPCyT: “Mecanismo molecular de la tolerancia a estrés biótico y abiótico conferida por la expresión de flavodoxina de cianobacterias en plantas superiores". Director: Dr. Néstor Carrillo
  • PIP 2012-11220110101075. CONICET: "Tolerancia a estrés en plantas transgénicas que expresan el sistema soluble ferredoxina NADP+reductasa/flavodoxina". Directora: Dra. AnabellaLodeyro

Director

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Carrillo, Néstor
Sede CCT
Email: carrillo@ibr-conicet.gov.ar
Tel: +54 341 4237070
Oficina Int: 636
Laboratorio Int: 613

Investigadores

  • Adriana Krapp
  • Anabella Lodeyro

Becarios Post-Doctorales

  • Juan Pierella Karlusich
  • Rodrigo Gómez

Becarios Doctorales

  • Martin Mayta
  • Paula Vicino

Tesinistas

  • Pamela Molinari