Bioquímica y Biología Molecular del Desarrollo

Resumen

Una de las preguntas fundamentales del desarrollo embrionario es cómo una única célula, el cigoto, es capaz de generar una importante variedad de tipos celulares diferentes que realizan funciones de manera coordinada en un organismo completo y complejo. Si bien se ha avanzado de manera notable en el conocimiento de los mecanismos moleculares responsables de los procesos de diferenciación celular, aún quedan aspectos que no son comprendidos plenamente.
El avance del conocimiento permitió demostrar que la regulación temporal y espacial de la expresión de genes particulares, los cuales a su vez participan de manera organizada en redes de regulación de la expresión génica, tienen una función principal en la diferenciación celular ordenada indispensable para un desarrollo embrionario normal. Alteraciones en la expresión de estos genes pueden derivar en patologías neonatales y/o comportamiento aberrante de las células en división, dando lugar a procesos tumorales e incluso el cáncer.
Numerosas proteínas y otros factores epigenéticos (metilación de ADN, modificaciones de histonas, ARNs no codificantes, etc.) han sido descriptos y caracterizados funcionalmente en el contexto del éxito del desarrollo embrionario. Sin embargo, es escaso el conocimiento de la función de las diferentes conformaciones del ADN en el control de la expresión génica durante el desarrollo embrionario. En los últimos años se han identificado y caracterizado estructuras no convencionales de los ácidos nucleicos participando de procesos de regulación de la expresión de genes.
Nuestras líneas de investigación están orientadas a evaluar el rol de los cuádruplex de guanina (G4), estructuras no canónicas de los ácidos nucleicos formadas por secuencias simple hebra ricas en guanina, en la regulación de la expresión de genes esenciales para el desarrollo de los vertebrados a nivel transcripcional, post-transcripcional y/o traduccional. Utilizamos el pez cebra (zebrafish) como modelo animal de experimentación y tecnologías clásicas de biología celular y del desarrollo, tales como sobreexpresión o silenciamiento de proteínas en cultivos celulares, estrategias de manipulación de los embriones para provocar variaciones en los niveles de proteínas específicas (pérdida de función por microinyección de oligonucleótidos morpholino o sobreexpresión de proteínas dominantes negativas, y ganancia de función por sobreexpresión de proteínas salvajes) y generación de líneas de peces transgénicas y/o mutantes (CRISPR-Cas9). Además, se emplean técnicas de biología molecular, bioquímicas y espectroscópicas (absorción, fluorescencia, dicroísmo circular y RMN) para estudios in vitro de las estructuras de G4 y sus alteraciones inducidas por variaciones genéticas, por interacción con proteínas o con moléculas ligandos específicas.
Como actividad complementaria y derivada del conocimiento sobre la biología del desarrollo del pez cebra, nuestro laboratorio es proveedor de embriones y ejemplares adultos de líneas salvajes (de referencia) y transgénicas de pez cebra, así como asesor en el montaje de sistemas de acuario para la cría y mantenimiento de este animal modelo. Además, hemos puesto a punto un test de ecotoxicidad utilizando embriones de pez cebra (DarT o FET) que es un método rápido, sencillo y de alta sensibilidad y reproducibilidad ampliamente utilizado en Europa para la acreditación de normas ISO en calidad de aguas y tratamiento de efluentes, así como la toxicidad de drogas sintéticas o naturales. El test es brindado como servicio a terceros para monitorear, en aguas, efluentes industriales y sedimentos, la presencia de sustancias potencialmente tóxicas para el hombre y el ecosistema.

Líneas de Investigación

Control de la expresión génica a través de Cuádruplex de Guanina

Cada vez son mayores las evidencias científicas de que el ADN puede adoptar una amplia variedad de estructuras secundarias alternativas a la doble hélice o forma B, denominadas “no-B” o “no canónicas”, entre las cuales se encuentran la forma Z (doble hélice levógira), ADN cruciforme, triple hélice de ADN (forma H), y cuádruplex de guanina (G4, estructura de 4 hebras ricas en G). Entre estas estructuras, los G4 han adquirido gran relevancia por su función en el control de la expresión génica y en la integridad del genoma. Además, los G4 se han descripto e identificado también como estructuras formadas por moléculas de ARN con diferentes funciones regulatorias en la expresión génica y en la estabilidad, procesamiento y funciones de estas moléculas. En el laboratorio se aborda esta temática mediante dos enfoques.
El primer abordaje estudia la función de los G4 en la regulación de la expresión génica durante el desarrollo embrionario. Los G4 han sido propuestos como reguladores en múltiples etapas de la expresión génica, desde su asociación con control de marcas epigenéticas, pasando por la regulación del inicio y elongación de la transcripción, la modulación del splicing, el control de la traducción y la regulación de la estabilidad de los ARNs (incluyendo la biogénesis y acción de microARNs). Si bien las hipótesis de la mayoría de estos mecanismos surgen de estudios bioinformáticos, en muchos casos sustentados por experimentos in vitro y en algunas ocasiones por datos de células en cultivo, existen muy pocas evidencias experimentales de estas funciones in vivo en organismos multicelulares. El objetivo general de esta línea es la identificación de mecanismos de control de la expresión génica regulados por estructuras no canónicas de los ácidos nucleicos y comprobar su funcionalidad in vivo. La hipótesis de trabajo plantea que los G4 funcionan como elementos reguladores de la expresión de genes durante el desarrollo embrionario a diferentes niveles que van desde el transcripcional hasta el post-transcripcional, y que la formación y función de dichos elementos está modulada por la acción de proteínas. Para esto se utilizan estrategias bioinformáticas mediante el análisis de repositorios de bases de datos genómicas y transcriptómicas y el uso de predictores estructurales; ensayos in vitro que involucran el uso de diferentes metodologías bioquímicas y biofísicas para poner en evidencia la formación, topología y estabilidad de las estructuras predichas; experimentos en células en cultivo para el análisis de la función de las estructuras identificadas en los mecanismos de regulación en el contexto celular y experimentos in vivo, utilizando el desarrollo embrionario del pez cebra (Danio rerio) como modelo de un proceso complejo de regulación de la expresión génica para comprobar las funciones regulatorias en el contexto de organismos multicelulares completos. Además, se estudia la función de factores proteicos y ligandos químicos con actividad específica sobre las estructuras G4 (ya sea desestabilizándolas, estabilizándolas o reconociéndolas) en la regulación de sus funciones.
El segundo abordaje estudia las variaciones patológicas de la expresión génica causada por polimorfismos genéticos en G4. Según datos generados por estudios bioinformáticos, el genoma humano posee más de 700.000 secuencias capaces de estructurarse como G4 (PG4). Estas secuencias están sobrerepresentadas en regiones reguladoras de la transcripción o la traducción de proto-oncogenes, sugiriendo un rol de estas estructuras en el control de la expresión génica y el consecuente desarrollo de tumores. Más recientemente se ha sugerido una vinculación de los G4 con la expresión de genes relacionados con el desarrollo de otras patologías humanas, tales como Parkinson y Alzheimer. Otros estudios recientes han demostrado la existencia de variantes polimórficas (tipo SNP o inserciones y deleciones cortas) de las PG4 presentes en regiones cercanas a las señales de inicio de la transcripción (TSS) y en las regiones 5’ no traducidas (5’UTRs) de los ARNm influyendo sobre la expresión génica. El objetivo general de esta línea es la identificación de polimorfismos en PG4 localizadas en regiones reguladoras de la expresión de genes asociados a patologías humanas y evaluar el efecto sobre la formación y/o estabilidad de los G4 y el control de la expresión de dichos genes. La hipótesis de trabajo plantea que las variantes polimórficas de las PG4 afectan la formación y/o estabilidad de los G4 y, de esta manera, influyen en el control de la expresión de genes asociados al desarrollo de patologías humanas contribuyendo tanto a la expresión génica diferencial entre individuos como a la predisposición al desarrollo de fenotipos patológicos. Para esta línea se utilizan estrategias de análisis bioinformático, ensayos in vitro y experimentos en células en cultivo, en conjunto con datos genéticos provenientes de bancos de datos de individuos con patologías determinadas. Investigador Responsable: Pablo Armas

Regulación de la expresión de genes relacionados con patologías humanas

Esta línea se centra en la identificación de las bases moleculares de patologías humanas de etiología aún no completamente dilucidada utilizando el modelado en el pez cebra. En particular, las anomalías craneofaciales congénitas son un grupo de defectos causados por el desarrollo anormal de la cabeza y los huesos faciales, que derivan fundamentalmente de las células de la cresta neural. Se estima que hay más de 500 síndromes con anomalías craneofaciales. La mayoría son morfológicos, afectando la forma y función de estructuras anatómicas de la cabeza y la cara.
El pez cebra ha surgido como una adenda poderosa al tradicional modelo murino para los estudios de la mayoría de los fenómenos biológicos, incluyendo la morfogénesis cráneo-facial. Las características principales del pez incluyen el desarrollo externo y transparencia óptica de los embriones, ambas particularidades facilitan la obtención de imágenes de embriones vivos y la utilización de métodos de genética directa y reversa. Aunque hay estructuras únicas en peces cebra, ratones y humanos, muchos de los mecanismos que rigen el crecimiento temprano y los patrones de la cara se comparten en todos los vertebrados. Por ejemplo, la convergencia de cresta neural frontonasal y maxilar ocurre análogamente en la formación del paladar duro de mamíferos y la placa etmoidal de pez cebra. También, las redes regulatorias de genes que rigen la diferenciación de tejidos relevantes son similares entre el pez cebra y los mamíferos. Esto significa que muchos hallazgos sobre el desarrollo del pez cebra, obtenidos gracias a la versatilidad de las herramientas experimentales disponibles para esa especie, son relevantes para el desarrollo facial de los mamíferos y, en algunos casos, para el entendimiento de los fundamentos genéticos de la hendidura orofacial. En este sentido y como ejemplo, el síndrome de Treacher Collins (TCS) es causado fundamentalmente por mutaciones autosómicas dominantes en el gen TCOF1. El síndrome presenta expresividad variable, desde muerte infantil por apnea hasta individuos muy poco afectados, los cuales son diagnosticados sólo a posteriori del nacimiento de algún descendiente que presenta las características del TCS. En estos últimos años hemos mostrado que el pez cebra es un modelo apropiado para el estudio del TCS ya que no solo replica la patogénesis descripta en seres humanos y en ratón, sino que, además, ha permitido hallazgos novedosos. En la actualidad, identificamos un grupo de genes que se encuentran bajo estudio para establecer sus relaciones biológicas y su rol molecular en la patogénesis del TCS.
Nuestro objetivo general es el estudio de la regulación y coordinación de la expresión de los genes que contribuyen a la morfogénesis craneofacial en el pez cebra. Nuestra hipótesis de trabajo sostiene que el funcionamiento de estos fenómenos regulatorios se conservaría entre vertebrados, lo cual nos permitiría no solo generar conocimiento básico sino también herramientas para su modulación e intervención cuando se asocian con patologías humanas. Investigadora Responsable: Gabriela Coux

Regulación de la expresión génica por miARNs en el desarrollo embrionario

Esta línea se centra en el estudio de la regulación de la expresión de genes involucrados en las etapas del desarrollo de la Cresta Neural (NC) por acción de microARNs. La NC es una población transitoria de células multipotentes capaces de diferenciarse en una gran variedad de derivados, incluyendo melanocitos, huesos y cartílagos de la cabeza, etc. Defectos de la formación de la NC dan lugar a neurocristopatías, que abarcan desde malformaciones craneofaciales hasta el melanoma. La formación de la NC ocurre en etapas, cada una de ellas caracterizada por la activación transcripcional de factores de transcripción específicos que actúan en complejas redes de regulación génica junto con modificadores de cromatina y ARN no-codificantes, incluyendo lncRNAs y microARNs (miRNAs). Haciendo uso de líneas transgénicas del pez cebra Danio rerio, identificamos (mediante secuenciación masiva seguida de análisis bioinformáticos) familias de miRNAs diferencialmente expresadas en dos etapas del desarrollo de la NC: la transición epitelio-mesénquima y la diversificación de las células de la NC. Utilizamos distintas metodologías de trabajo tales como microinyecciones en embriones de pez cebra, expresión de genes reporteros, generación de líneas mutantes y transgénicas, metodología CRISPR, hibridación in situ, RT-qPCR y Western Blot para evaluar la relación entre los miRNAs con las redes de regulación génica de las distintas etapas del desarrollo de la NC. Además, se han iniciado estudios para identificar y comprobar experimentalmente el rol de las estructuras G4 en la función in vivo de los miRNAs durante el desarrollo embrionario del pez cebra, ya sea en la regulación de su transcripción, en su biogénesis o en la accesibilidad de sus sitios blanco.
El objetivo general de este proyecto es identificar y caracterizar funcionalmente familias de miRNAs diferencialmente expresadas durante las etapas de EMT/delaminación y diversificación de las células de NC, a fin de contribuir al conocimiento global de la GRN que gobierna la formación de la NC y sus derivados. El proyecto plantea dos hipótesis de trabajo: 1) La expresión de miRNAs en las etapas de EMT/delaminación y diversificación contribuye al desarrollo normal de la NC y sus derivados. 2) Alteraciones en los niveles de miRNAs involucrados en la GRN de la diferenciación de los melanocitos promueven el desarrollo del melanoma. Investigadora Responsable: Andrea Weiner

Publicaciones Seleccionadas

  • Melo US, Macedo-Souza LI, Figueiredo T, Muotri AR, Gleeson JG, Coux G, Armas P, Calcaterra NB, Kitajima JP, Amorim S, Olávio TR, Griesi-Oliveira K, Coatti GC, Rocha CR, Martins-Pinheiro M, Menck CF, Zaki MS, Kok F, Zatz M, Santos S (2015). Overexpression of KLC2 due to a homozygous deletion in the non-coding region causes SPOAN syndrome. Hum Mol Genet. 24(24): 6877-6885. DOI: 10.1093/hmg/ddv388
  • David AP, Margarit E, Domizi P, Banchio C, Armas P, Calcaterra NB (2016). G-quadruplexes as novel cis-elements controlling transcription during embryonic development. Nucleic Acids Res. 44: 4163-4173. DOI: 10.1093/nar/gkw011
  • Porcel de Peralta MS, Mouguelar VS, Sdrigotti MA, Ishiy F, Fanganiello RD, Passos-Bueno MR, Coux G, Calcaterra NB. (2016). Cnbp ameliorates Treacher Collins Syndrome craniofacial anomalies through a pathway that involves redox-responsive genes. Cell Death & Disease, 7: e2397. DOI: 10.1038/cddis.2016.299.
  • Armas P, David A, Calcaterra NB (2017). Transcriptional control by G-quadruplexes: in vivo roles and perspectives for specific intervention. Transcription., 8: 21-25. DOI: 10.1080/21541264.2016.1243505.
  • Armas P, Calcaterra NB (2018). G-quadruplex in animal development: Contribution to gene expression and genomic heterogeneity. Mech Dev. 154: 64-72. DOI: 10.1016/j.mod.2018.05.004
  • Weiner AMJ (2018). MicroRNAs and the neural crest: From induction to differentiation. Mech Dev. 154: 98-106. DOI: 10.1016/j.mod.2018.05.00
  • Rosas MG, Lorenzatti A, Porcel de Peralta MS, Calcaterra NB, Coux G (2019). Proteasomal inhibition attenuates craniofacial malformations in a zebrafish model of Treacher Collins Syndrome. Biochem Pharmacol. 163: 362-370. DOI: 1016/j.bcp.2019.03.005
  • Weiner AMJ, Scampoli NL, Steeman TJ, Dooley CM, Busch-Nentwich EM, Kelsh RN, Calcaterra NB (2019). Dicer1 is required for pigment cell and craniofacial development in zebrafish. Biochim Biophys Acta Gene Regul Mech. 1862(4): 472-485. DOI: 10.1016/j.bbagrm.2019.02.005
  • David AP, Pipier A, Pascutti F, Binolfi A, J Weiner AM, Challier E, Heckel S, Calsou P, Gomez D, Calcaterra NB, Armas P (2019). CNBP controls transcription by unfolding DNA G-quadruplex structures. Nucleic Acids Res. 47(15): 7901-7913. DOI: 10.1093/nar/gkz527
  • Cedron VP, Weiner AMJ, Vera M, Sanchez, L (2020). Acetaminophen affects the survivor, pigmentation and development of craniofacial structures in zebrafish (Danio rerio) embryos. Biochemical Pharmacology 174: 113816. DOI: 10.1016/j.bcp.2020.113816
  • Weiner AMJ, Coux, G, Armas, P, Calcaterra N (2021). Insights into vertebrate head development: from cranial neural crest to the modelling of neurocristopathies. Int J Dev Biol. 65: 215-225. DOI: 10.1387/ijdb.200229nc
  • Bezzi G, Piga E, Binolfi A, Armas P (2021). CNBP Binds and Unfolds In Vitro G-Quadruplexes Formed in the SARS-CoV-2 Positive and Negative Genome Strands. Int. J. Mol. Sci. 22(5): 2614. DOI: 10.3390/ijms22052614
  • Steeman TJ, Rubiolo JA, Sánchez LE, Calcaterra NB, Weiner AMJ (2021). Conservation of Zebrafish MicroRNA-145 and Its Role during Neural Crest Cell Development. Genes (Basel) 12(7): 1023. DOI: 10.3390/genes12071023
  • Armas P, Coux G, Weiner AMJ, Calcaterra N (2021). What's new about CNBP? Divergent functions and activities for a conserved nucleic acid binding protein. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. In press. DOI: 10.1016/j.bbagen.2021.129996