Metaloproteínas

Resumen

La investigación que se lleva a cabo en nuestro laboratorio aborda tres grandes áreas de interés: la caracterización de las metalo-β-lactamasas, enzimas de zinc involucradas en la resistencia mostrada por algunas bacterias patógenas a antibióticos β-lactámicos, la caracterización de proteínas de cobre involucradas en la respiración celular, y la caracterización de proteínas de membrana involucradas en la mecanismos de resistencia a antibióticos polimixinas.

En cuanto a las metalo-β-lactamasas (MβLs), estamos actualmente abocados a diseñar y evaluar inhibidores de estas enzimas, en base a resultados previos del grupo que sustentan la hipótesis de que las diferentes clases de MβLs actúan utilizando el mismo mecanismo catalítico, pese a la diversidad estructural de las mismas.

En cuanto al estudio de las proteínas de cobre citocromo c oxidasas (COX), enzimas encargadas de la reducción de oxígeno en la etapa final de la respiración celular, el grupo está dedicado a caracterizar los mecanismos biológicos de transporte e inserción de iones cobre, y la regulación de la función de los sitios de cobre encontrados en estas proteínas mediante el ajuste fino de su estructura electrónica y tridimensional.

En cuanto a la caracterización de las proteínas de membrana responsable de generar resistencia a polimixinas (por ej. colistina) estamos abocados a dilucidar las propiedades bioquímicas y estructurales que permiten que la métalo proteína MCR modifique la composición del LPS de la membrana bacteriana.

Nuestro grupo lleva adelante un estudio interdisciplinario, usando técnicas de biología molecular, bioquímica, biología estructural clásica (difracción de rayos X), espectroscopia (resonancia magnética nuclear, absorción, fluorescencia, dicroísmo circular, entre otras técnicas), y enzimología moderna (cinética de estado estacionario y mezcla rápida). Además, empleamos evolución dirigida in vitro como un medio para pronosticar la evolución de las proteínas en estudio.

Líneas de Investigación

Resistencia a antibióticos: Evolución, diversidad estructural y mecanismo catalítico de Metalo-β-Lactamasas.

Los antibióticos β-lactámicos son los agentes quimioterapéuticos más empleados para el tratamiento de infecciones bacterianas. El principal mecanismo de resistencia a estos fármacos es la síntesis de β-lactamasas, enzimas que hidrolizan e inhiben la acción de estos antibióticos. Las metalo-β-lactamasas (MβLs) constituyen la generación más reciente de estas enzimas. Las MβLs poseen un amplio espectro de acción, ya que inactivan todos los antibióticos β-lactámicos, incluidos los carbapenemes (el último recurso empleado en la clínica).

La diseminación de genes que codifican estas enzimas en organismos oportunistas y patógenos es hoy de escala mundial. Este cuadro se agrava por la diversidad estructural de las distintas MβLs, que dificulta el diseño de un inhibidor eficiente para estas enzimas. La enzima NDM-1 (http://www.bbc.co.uk/news/health-10925411), en particular, está siendo diseminada en todo el mundo rápidamente, y no se cuenta con inhibidores de uso clínico para estas enzimas, lo que representa una amenaza para la salud mundial.

Nuestro objetivo es elucidar la relación estructura-función de estas enzimas mediante estudios bioquímicos, estructurales, mecanísticos y evolutivos, con el fin último de diseñar un inhibidor de aplicación clínica. Hasta el momento, hemos logrado: (1) proponer un mecanismo catalítico común para las MβLs a partir de la caracterización de un intermediario de reacción, (2) identificar la especie funcional in vivo de las mismas y (3) explorar sus posibles mecanismos evolutivos. En la actualidad, utilizamos estos conocimientos previos para diseñar y generar inhibidores de MβLs, bajo la hipótesis de que, a pesar de su diversidad estructural, las MβLs actúan utilizando el mismo mecanismo catalítico.

Nuestro grupo lleva adelante un estudio interdisciplinario, usando técnicas de biología molecular, bioquímica, biología estructural y enzimología moderna. Los estudios mecanísticos se realizan usando técnicas de mezcla rápida y varias espectroscopías para seguir cambios en el sitio activo durante el recambio catalítico en la escala de tiempo de los milisegundos, con el propósito de identificar intermediarios de reacción.

Utilizamos cristalografía y/o Resonancia Magnética Nuclear (RMN) para caracterizar el modo de unión de posibles inhibidores a estas enzimas. También usamos estrategias de evolución dirigida in vitro como un medio para pronosticar la evolución de estas enzimas en ambientes hospitalarios, y para entender de qué modo se fijan las mutaciones en el proceso evolutivo.

Cobre en sistemas biológicos: Control de la reactividad y mecanismo de inserción de sitios de cobre de transferencia electrónica.

La respiración celular depende del control fino de una serie de procesos de oxido-reducción, que culminan en la reducción de oxígeno llevada a cabo por las citocromo c oxidasas. El cobre es un metal de transición esencial para la transferencia electrónica en estas enzimas, siendo a la vez tóxico a altas concentraciones. Por lo tanto, su concentración intracelular y mecanismos de transporte y almacenamiento deben estar finamente regulados.

Nuestro grupo estudia: (1) los mecanismos biológicos de transporte e inserción de iones cobre en oxidasas terminales y (2) la regulación de la función de estos sitios mediante el ajuste fino de su estructura electrónica y tridimensional. Hemos identificado las proteínas involucradas en el transporte e inserción de cobre en el sitio CuA de citocromo oxidasas bacterianas, y caracterizado estructuralmente el mecanismo de unión a metal empleando RMN. Para estudiar la estructura electrónica de estos sitios, los métodos de biología estructural clásicos resultan insuficientes, ya que sólo proveen la estructura tridimensional.

En nuestro laboratorio utilizamos varias técnicas espectroscópicas (principalmente RMN) para analizar la distribución electrónica en sitios de cobre, y estudiar de qué modo la misma determina la transferencia de electrones a distancia. Hemos empleado esta estrategia para describir el ajuste fino de la reactividad en proteínas azules de cobre, y en la actualidad estamos aplicando nuestra experiencia en el estudio del sitio de cobre CuA en citocromo c oxidasas. Hemos propuesto que la alta eficiencia del sitio CuA en transferencia electrónica a distancia se debe fundamentalmente a la presencia de estados electrónicos excitados de baja energía que se encuentran poblados a temperatura ambiente.

Publicaciones Seleccionadas

  • M.N. Lisa, A.R. Palacios, M. Aitha, M. M. González, D.M.Moreno, M.W. Crowder, J. Spencer, D.L. Tierney, L.I. Llarrull and A. J. Vila “A General Reaction Mechanism for Mono- and Binuclear Metallo-β-lactamases”, Nature Communications, doi: 10.1038/s41467-017-00601-9. (2017).
  • P.Hinchliffe, M.M. González, M. F. Mojica, J. M. González, V. Castillo, C. Saiz, M. Kosmopoulou, C. L. Tooke, L. I. Llarrull, G. Mahler , R. A. Bonomo , A.J. Vila*, J. Spencer* “Cross-class metallo-β-lactamase inhibition by bisthiazolidines reveals multiple binding modes”, Proc.Natl.Acad.Sci USA, 111, E3745-54 (2016).
  •  L.J. González, G. Bahr, T.G. Nakashige, E.M. Nolan, R.A. Bonomo and A.J.Vila “Membrane-anchoring stabilizes New Dehli carbapenemase NDM-1 upon zinc starvation and favors protein export into vesicles”, Nature Chemical Biology, 12, 516-22  (2016). -
  •  M.N. Morgada, L.A. Abriata, C. Cefaro, K.Gajda, L. Banci and A.J.Vila “Loop recognition and copper-mediated disulfide reduction underpin metal site assembly of CuA in human cytochrome oxidase", Proc.Natl.Acad.Sci USA, 112, 11771-6 (2015).
  • M.N.Morgada, L.A.Abriata, U.Zitare, D.Álvarez-Paggi, D.H.Murgida and A. J.Vila “Control of the electronic ground state on an electron transfer copper site by second-sphere perturbations", Angew.Chemie, 10, 6188-92 (2014).
  •  L.A.Abriata, D.Álvarez-Paggi, G.N.Ledesma, N.J.Blackburn, A.J.Vila* and D.H.Murgida* “Alternative ground states enable pathway switching in biological electron transfer”, Proc.Natl.Acad.Sci USA, 109, 17348-53 (2012)
  • J.M.González, M.R.Meini, P.E.Tomatis, F.J.Medrano, J.A.Cricco and A.J.Vila “Metallo-β-lactamases withstand low Zn(II) conditions by tuning metal-ligand interactions”, Nature Chemical Biology, 8, 698-700 (2012)
  • M.E.Zaballa, L.A. Abriata, A.Donaire and A.J.Vila “Flexibility of the metal binding region in apo-cupredoxins” Proc.Natl.Acad.Sci USA, 109, 9254-9 (2012). 700
  • P.E.Tomatis, S.M.Fabiane, F.Simona, P.Carloni, B.J.Sutton and A.J.Vila, “Adaptive protein evolution grants organismal fitness by improving catalysis and flexibility”, Proc.Natl.Acad.Sci.USA105, 20605-20610 (2008).
  •  M.F.Tioni, L.I.Llarrull, A.A.Poeylaut-Palena, M.A.Martí, M.Saggu, G.R.Periyannan, E.G.Mata, B.Bennett, D.H.Murgida and A.J.Vila “Trapping and Characterization of a Reaction Intermediate in Imipenem Hydrolysis by B. cereus Metallo-b-lactamase”, J.Am.Chem.Soc., 130, 15852-15863 (2008).
  • L.A.Abriata, L.Banci, I.Bertini, S.Ciofi-Baffoni, P.Gkazonis, G.A.Spyroulias, A.J.Vila, S.Wang “Mechanism of CuA assembly”, Nature Chem.Biol., 4, 599-601 (2008).

Colaboradores

  • Harry Gray (California Institute of Technology, USA).
  • Robert Bonomo (Cleveland, MD - Case Western Reserve University School of Medicine, USA).
  • Jim Spencer (University of Bristol, U.K).
  • Daniel Murgida (FCEN-UBA Argentina).
  • Ninian Blackburn (Oregon Graduate Institute, USA).
  • Graciela Mahler (Universidad de la República, Montevideo, Uruguay).
  • Matteo Dal Peraro, Luciano Abriata (École Polytechnique Fédérale de Lausanne, Lausana, Suiza)

Subsidios

  • NIH, R01AI100560-01, National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAD).
  • PICT-2015-0974. Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica.
  • Plataforma Tecnológica (Concurso PPL-2- 2012-2016). Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica.
  • PICT-2016-1656. Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica.

Director

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Vila, Alejandro J.
Sede CCT
Email: vila@ibr-conicet.gov.ar
Tel: +54 341 4237070
Oficina Int: 632
Laboratorio Int: 611

Investigadores

Becarios Post-Doctorales

  • Carolina López
  • Marcos Morgada

Becarios Doctorales

  • Guillermo Bahr
  • Estefania Giannini
  • Alcides J. Leguto
  • Ma. Eugenia Llases
  • Antonela R. Palacios
  • Ma. Agustina Rossi

Tesinistas

  • Juan Pablo Rebechi
  • Gina Dotta

Imágenes