Mecanismos de resistencia bacteriana a antimicrobianos

Resumen

En nuestro grupo estamos interesados en comprender tanto los mecanismos bacterianos de resistencia a antibióticos β-lactámicos (en particular, a carbapenemes), así como los reservorios ambientales y diseminación de genes involucrados en la misma en bacterias Gram-negativas, con especial énfasis en aquellas responsables de infecciones nosocomiales en nuestro medio. En la bacteria patógena oportunista Acinetobacter baumannii dicha resistencia es atribuida tanto a una disminución de la permeabilidad de la membrana externa (ME), impidiendo así al antibiótico alcanzar su sitio de acción en el periplasma bacteriano, como a la presencia de β-lactamasas periplasmáticas con actividad carbapenemasa. Estamos estudiando la contribución de cada uno de estos mecanismos en cepas clínicas multirresistentes locales de A. baumannii, habiendo identificado en las mismas canales proteicos de ME como CarO involucrados en el influjo de carbapenemes. Hemos encontrado que cepas clínicas con mutaciones particulares que resultan en la desaparición de estos canales o generan ciertas modificaciones estructurales en CarO poseen mayor resistencia a carbapenemes. Estamos actualmente estudiando el rol de CarO en la fisiología y patología de A. baumannii, y encontramos que funciona como canal con alta especificidad para aminoácidos básicos como L-ornitina, compuesto abundante en heridas y quemaduras. Asimismo, hemos detectado un importante nivel de polimorfismo en el gen carO en la población clínica de A. baumannii y el intercambio de variantes de carO mediante transmisión horizontal de genes, pudiendo contribuir así a la diseminación de resistencia a carbapenemes.
Estamos identificando reservorios bacterianos ambientales de genes de resistencia a carbapenemes a nivel local. Hemos identificado recientemente distintos aislamientos no relacionados genéticamente de la bacteria ambiental Pseudomonas putida como reservorios del gen blaVIM-2, el cual codifica una metalo-β-lactamasa (MBL) que también confiere resistencia a carbapenemes. Asimismo hemos encontrado que dicho gen está presente en un integrón de clase 1 el cual se encuentra presente dentro de un transposón del tipo Tn402, estando todo este arreglo contenido a su vez en un plásmido conjugativo de elevado rango de hospedador. Esta compleja plataforma en arreglo “muñeca rusa”, presente en un reservorio ambiental como P. putida podría explicar la amplia diseminación local de blaVIM-2 entre patógenos oportunistas nosocomiales, tema que estudiamos en la actualidad.
Finalmente, analizamos asimismo la cooperación entre asistentes de plegado proteicos (chaperones moleculares) tanto citoplasmáticos como periplasmáticos en el proceso de biogénesis de MBL responsables de resistencia general a β-lactámicos en bacterias Gram-negativas. Utilizando como modelo la secreción de la MBL GOB en Escherichia coli, la cual promueve la adquisición de resistencia a diversos β-lactámicos incluyendo carbapenemes, hemos identificado roles de diversos chaperones incluyendo un sistema DnaK “expandido” como asistentes para el tránsito citoplasmático de la pre-proteína en un estado competente para ser secretada por SecA-SecYGE. Mediante estudios genéticos estamos identificando asimismo proteínas periplasmáticas involucradas en la biogénesis de GOB. Los resultados obtenidos permitirán detectar potenciales blancos terapéuticos para el tratamiento de infecciones bacterianas.

Líneas de Investigación

Mecanismos de evolución y diseminación de resistencia a carbapenemes en bacilos Gram-negativos no fermentadores de importancia clínica

La utilización masiva de antibióticos en ambientes nosocomiales ha generado la selección de cepas bacterianas con múltiples resistencias (MR) a diversos antimicrobianos. Muchos de estos microbios han demostrado un gran potencial de evolucionar nuevos mecanismos de resistencia, sea tanto por mutaciones y re-arreglos genómicos internos como por co-optación de genes exógenos desde reservorios ambientales mediada por transferencia horizontal de genes (THG), así como de constituirse en “arquitectos” de nuevas plataformas genéticas portadoras de determinantes de MR de rápida diseminación. La introducción de nuevos antibióticos es así seguida por la rápida selección de nuevas cepas resistentes, constituyendo un círculo vicioso que requiere de respuestas racionales basadas en un detallado conocimiento de la fisiología de los patógenos involucrados, de los mecanismos de resistencia, y de la potencialidad y vías de THG. Las preguntas que intentamos responder en esta parte están así referidas a elucidar mecanismos de resistencia presentes en patógenos Gram-negativos aeróbicos de los géneros Acinetobacter (familia Moraxellaceae) y Pseudomonas (familia Pseudomonadaceae), detectar reservorios de genes involucrados en los mismos, plataformas genéticas que los contienen, y mecanismos de THG involucrados en su diseminación.

  • Acinetobacter baumannii

El patógeno nosocomial oportunista A. baumannii ha cobrado importancia a nivel local y mundial en los últimos años por el aumento en incidencia y mortalidad de las infecciones causadas por las mismas, especialmente en individuos inmunocomprometidos o sometidos a procesos politraumáticos. Los factores que contribuyen a la creciente patogenicidad de A. baumannii son aún poco conocidos, existiendo considerable variabilidad entre aislamientos obtenidos en distintas zonas geográficas. Ello hace a este microbio un desafío poco convencional, indicando asimismo la importancia del estudio de cepas locales para intentar su control y eventual erradicación. La persistencia de cepas MR de A. baumannii en el entorno hospitalario se atribuye a una combinación de mecanismos que incluyen elevada resistencia a desafíos ambientales y alta capacidad de evolucionar o cooptar determinantes de MR mediante THG. Un ejemplo relevante está dado por la evolución de resistencia a antibióticos β-lactámicos como los carbapenemes, generalmente último recurso terapéutico. Los carbapenemes penetran la membrana externa (ME) bacteriana mediante canales proteicos denominados porinas, inactivando distintas PBP periplasmáticas y afectando la síntesis de mureína. Entre los mecanismos de resistencia más relevantes podemos mencionar la producción de β-lactamasas con actividad carbapenemasa, mutaciones que llevan a la eliminación de ciertas porinas o modificación de su estructura, o combinaciones de ambos. Aun así existe poca información sobre posibles porinas de A. baumannii responsables del ingreso de carbapenemes, posibles actividades sinérgicas entre carbapenemasas y alteraciones de la permeabilidad, y plataformas genéticas portadoras de genes de resistencia y sus mecanismos de transmisión. Nosotros encontramos que la desaparición de una proteína de ME perteneciente a una familia que denominamos CarO se correlacionó con resistencia aumentada a carbapenemes en cepas clínicas locales de A. baumannii. Hemos asimismo encontrado que miembros de esta familia son porinas para aminoácidos básicos, permitiendo asimismo la entrada de carbapenemes por sus características estructurales similares. Postulamos que el intercambio de distintas variantes de CarO mediante THG en la población de A. baumannii forma parte de la estrategia de la bacteria para adaptarse a condiciones ambientales cambiantes, incluyendo el ambiente hospitalario. Encontramos asimismo distintas secuencias de inserción (IS) interrumpiendo el gen carO en A. baumannii, y que la inserción de una de ellas (ISAba825) corriente arriba de un gen blaOXA-58 genera un promotor híbrido que lleva a la sobreproducción de OXA-58 y resistencia concomitante a carbapenemes. Dicho arreglo se encuentra en plásmidos presentes en cepas clínicas y responsables de resistencia a carbapenemes. Postulamos así roles sinérgicos para las IS en la modulación de la resistencia a carbapenemes en A. baumannii, implicando tanto la inactivación de canales de ME para estos antimicrobianos como sobreproducción de carbapenemasas a partir de plásmidos de posible adquisición mediante THG.

Nuestro trabajo actual se centra en: i) evaluar la contribución de permeabilidad reducida de ME y de carbapenemasas a la resistencia a carbapenemes; ii) caracterizar el rol de la distintas variantes de CarO en la fisiopatología de A. baumannii; iii) caracterizar plataformas genéticas portadoras de determinantes de resistencia a carbapenemes y evaluar el rol de la THG en la diseminación de las mismas entre la población clínica de este patógeno oportunista.

  • Pseudomonas spp. 

La evolución de la resistencia a antimicrobianos en el escenario clínico es impredecible. En este contexto, y bajo la hipótesis de que los genes de resistencia evolucionan en bacterias sometidas a presión selectiva antimicrobiana, es esencial dilucidar variantes nuevas y/o plataformas genéticas que portan determinantes de resistencia de aparición reciente. Nuestro objetivo aquí es estudiar, desde una perspectiva evolutiva, los fenómenos involucrados en la emergencia de resistencia a carbapenemes mediada por metalo-β-lactamasas (MBL) y su transferencia en patógenos oportunistas nosocomiales pertenecientes al género Pseudomomas. El conocimiento de los mecanismos implicados en estos procesos tendrá un impacto positivo sobre la elección de terapias y prácticas de control de infecciones nosocomiales debidas a cepas MR de Pseudomonas aeruginosa.

Nosotros encontramos un nuevo e inusual integrón de clase 1 en una cepa de Pseudomonas spp de origen clínico portador de un gen de la MBL VIM-2 (blaVIM-2), incluido en un transposón completo del tipo-Tn402 e inserto a su vez en un plásmido conjugativo de amplio rango de hospedador para pseudomonas y enterobacterias. La secuencia completa del plásmido portador mostró un diseño quimérico conformado por módulos derivados tanto de patógenos oportunistas como de bacterias ambientales. Estas observaciones nos llevan a postular que bacterias ambientales del género Pseudomonas constituyen reservorios de dichos módulos, siendo responsables de su reclutamiento y ensamblado en plataformas genéticas y sistemas de transferencia compatibles con patógenos hospitalarios incluyendo P. aeruginosa.

Nuestro trabajo actual se centra en: i) Caracterizar plataformas genéticas de genes de MBL presentes en aislamientos hospitalarios locales de Pseudomonas spp resistentes a carbapenemes; ii) Caracterizar las posibles bases moleculares de su diseminación hacia patógenos oportunistas; iii) Realizar estudios comparativos de los entornos genómicos de dichos genes con los presentes en cepas clínicas de P. aeruginosa de coexistencia espacial y/o cronológica, a fin de elucidar posibles eventos de transferencia de dichos determinantes de resistencia hacia estos patógenos hospitalarios.

 

Biogénesis de proteínas de secreción involucradas en la resistencia bacteriana a antimicrobianos y adaptabilidad al medio en bacterias Gram-negativas

Las proteínas responsables de la resistencia a β-lactámicos, sean estas canales de ME o β-lactamasas periplasmáticas, requieren de ser secretadas desde el citoplasma bacteriano y alcanzar sus correspondientes compartimientos de acción. Las bacterias poseen sistemas evolutivamente conservados como Sec que colaboran con distintos asistentes de plegado (chaperones moleculares) para asegurar la correcta biogénesis proteica. Los chaperones moleculares son complejas maquinarias proteicas que participan en la homeostasis proteica previniendo la agregación de polipéptidos incorrectamente plegados, asistiendo su plegado, transporte intracelular, mantenimiento estructural, degradación, etc. La cooperación entre elementos del sistema de secreción y distintos chaperones en el complejo ambiente celular son poco conocidas, si bien la disfunción y/o falta de cooperación entre estas maquinarias promueve alteraciones en la resistencia a situaciones de estrés y aún en la patogenia con lo cual la comprensión precisa de su accionar conlleva relevancia tanto básica como aplicada. Así, otra de las líneas en estudio involucra el estudio de la cooperación entre las maquinarias arriba mencionadas en el proceso de biogénesis proteica en bacterias Gram-negativas, con especial énfasis en proteínas de secreción relacionadas con resistencia antibiótica y adaptabilidad al entorno.

Hemos identificado y clonado los genes de la MBL GOB de un aislamiento clínico del patógeno Gram-negativo Elizabethkingia meningoseptica, y caracterizado dicha enzima respecto a su rango de sustratos y requerimiento de ión metálico, mecanismos de secreción y plegado y adquisición de Zn(II) en el periplasma. Encontramos que el sistema citoplasmático de chaperones DnaK es el principal colaborador de la maquinaria Sec en la secreción de GOB, que el ión metálico es incorporado en el periplasma, y que proteínas periplasmáticas como DacD poseen roles directos o indirectos en la estabilización de la apoenzima secretada a este compartimiento. Continuamos en la actualidad con el estudio de factores citoplasmáticos y periplasmáticos con capacidad de asistir el plegado productivo tanto de MBL como de proteínas de ME involucradas en la adaptación de la bacteria a distintos desafíos ambientales de naturaleza química y física.

Publicaciones Seleccionadas

  • Marchiaro PM, Brambilla L, Morán-Barrio J, Revale S, Pasteran F, Vila AJ, Viale AM, Limansky AS. (2014) The complete nucleotide sequence of the carbapenem resistance-conferring conjugative plasmid pLD209 from a Pseudomonas putida clinical strain reveals a chimeric design formed by modules derived from both environmental and clinical bacteria. Antimicrob Agents Chemother., 58, 1816-1821.
  • Brambilla L, Morán-Barrio J, Viale AM. (2014) Expression of the Escherichia coli ompW colicin S4 receptor gene is regulated by temperature and modulated by the H-NS and StpA nucleoid-associated proteins. FEMS Microbiol Lett., 352, 238-244.
  • Brambilla L, Morán-Barrio J, Viale AM. (2014) Low molecular mass PBP6b (DacD) is required for an efficient GOB-18 metallo-β-lactamase biogenesis in Salmonella enterica and Escherichia coli. Antimicrob Agents Chemother., 58, 205-211.
  • Golic A, Vaneechoutte M, Nemec A, Viale AM, Actis LA, Mussi MA. (2013) Staring at the cold sun: blue light regulation is distributed within the genus Acinetobacter. PLoS One, 8:e55059.
  • Stietz MS, Ramírez MS, Merkier AK, Jeric P, Limansky AS, Centrón D, Catalano M. (2013) Acinetobacter baumannii extensively drug resistant lineages in Buenos Aires hospitals differ from the international clones I-III. Infection, Genetics and Evolution, 14, 294-301.
  • Ramírez MS, Vilacoba E, Stietz MS, Merkier AK, Jeric P, Limansky AS, Márquez C, Bello H, Catalano M, Centrón D. (2013) Spreading of AbaR-type genomic islands in multidrug resistance Acinetobacter baumannii strains belonging to different clonal complexes. Curr Microbiol., 67, 9-14.
  • Mussi MA, Limansky AS, Relling V, Ravasi P, Arakaki A, Actis LA, Viale AM. (2011) Horizontal gene transfer and assortative recombination within the Acinetobacter baumannii clinical population provide genetic diversity at the single carO gene, encoding a major outer membrane protein channel. J Bacteriol., 193, 4736-4748.
  • Ravasi P, Limansky AS, Rodriguez RE, Viale AM, Mussi MA (2011) ISAba825, a functional insertion sequence modulating genomic plasticity and bla(OXA-58) expression in Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother., 55, 917-920.
  • Mussi MA, Gaddy JA, Cabruja M, Arivett BA, Viale AM, Rasia R, Actis LA. (2010) The opportunistic human pathogen Acinetobacter baumannii senses and responds to light. J Bacteriol., 192, 6336-6345.
  • Marchiaro P, Viale AM, Ballerini V, Rossignol G, Vila AJ, Limansky A. (2010) First report of a Tn402-like class 1 integron carrying blaVIM-2 in Pseudomonas putida from Argentina. J Infect Dev Ctries., 4, 412-416.
  • Morán-Barrio, J., Limansky, A.S., Viale, A.M. (2009) Secretion of GOB metallo-β-lactamase in Escherichia coli strictly depends on the cooperation between the cytoplasmatic DnaK chaperone system and the Sec machinery: Completion of folding and Zn(II) ion acquisition occur in the bacterial periplasm. Antimicrobial Agents and Chemotherapy,  53, 2908-2917.

Colaboradores

  • Alejandro J. Vila, IBR. Caracterización de metalo-β-lactamasas obtenidas de aislamientos locales de patógenos hospitalarios.
  • Fernando Pasteran, Departamento Bacteriología, INEI - ANLIS “Dr. Carlos G Malbrán”.

Subsidios

  • PIP GI CONICET 2012-2014: “Chaperones moleculares y proteasas involucrados en la biogénesis de proteínas de secreción y el mantenimiento de la homeostasis proteica en bacterias”.
  • PICT-2011-1020 2012-2015: "Contribución de proteínas de membrana externa y fotorreceptores a la adaptablidad del patógeno oportunista Acinetobacter baumannii a desafíos ambientales".
  • PICT 2012-0680: “Resistencia a carbapenemes mediada por metalo-beta-lactamasas en Pseudomonas spp: plataformas genéticas responsables de su diseminación e impacto clínico de nuevas variantes”. Director: A. Limansky.
  • PID BIO377 SeCyT, UNR: “Epidemiología Molecular de la Resistencia a Carbapenemes Mediada por Serino- y Metalo-B-lactamasas en Bacilos Gram-Negativos de Origen Nosocomial”. Director: A. Limansky.

Director

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Viale, Alejandro M.
Sede Facultad
Email: viale@ibr-conicet.gov.ar
Tel: +54 341 4351235
Oficina Int: 116
Laboratorio Int: 115

Investigadores

  • Adriana S. Limansky
  • Jorgelina Morán Barrio
  • Patricia Marchiaro
  • Guillermo Repizo

Becarios Doctorales

  • María M. Cameranesi
  • Marco Brovedan

Tesinistas

  • Carolina Fabbri

Otro Personal

  • Viviana Ballerini (Pasante)
  • María Susana Díaz (Pasante)

Imágenes

Evolución de la resistencia a antibióticos carbapenemes en bacterias por producción de carbapenemasas y/o reducción de la permeabilidad de la membrana externa debido a la pérdida o mutación de porinas específicas.