Sensores bacterianos

Resumen

La investigación que se lleva a cabo en nuestro laboratorio se inserta en un área prioritaria: el estudio de los mecanismos de resistencia a antibióticos y el desarrollo de estrategias para contrarrestarlos. El rápido desarrollo de resistencia a los antibióticos representa un gran desafío para la prevención y el tratamiento de infecciones bacterianas. Este desafío se ve incrementado dado el reducido número de compuestos antibacterianos en etapas finales de evaluación para el uso clínico, y dada la significativa reducción en la inversión de las industrias farmacéuticas en el desarrollo de nuevos compuestos antibacterianos. Es crítico poder identificar nuevos blancos para el diseño de compuestos que puedan emplearse en el tratamiento clínico de infecciones debidas a bacterias resistentes y que presenten mecanismos de acción diferentes a los empleados por los antibióticos actualmente disponibles. En nuestro grupo estudiamos los sistemas inducibles por antibióticos de dos patógenos de gran relevancia en el campo de la salud: Staphylococcus aureus y Vibrio parahaemolyticus. Específicamente, abordamos la caracterización de proteínas de membrana bacterianas que detectan directa o indirectamente la presencia de antibióticos y activan la expresión de genes de resistencia. Estas proteínas de membrana son excelentes blancos para el diseño de compuestos inhibidores que permitan restablecer la eficacia de los antibióticos β-lactámicos y/o glicopéptidos para el tratamiento de infecciones. Por un lado, estamos estudiando a las proteínas sensoras de los sistemas bla y mec de resistencia a antibióticos β-lactámicos de Staphylococcus aureus meticilina-resistente (MRSA, por las siglas en inglés). Por otro lado, pretendemos caracterizar el mecanismo mediante el cual los sistemas de dos y tres componentes VbrK/VbrR de V. parahaemolyticus y VraSRT de S. aureus reconocen antibióticos β-lactámicos o glicopéptidos y transmiten la señal al citoplasma. Empleamos un enfoque multidisciplinario que involucra el uso de compuestos fotoactivables, biología molecular, ensayos bioquímicos, modelado y biología estructural. Además, estamos abocados a la búsqueda de compuestos capaces de inhibir la activación de estos sistemas, y que puedan restablecer la eficacia de los antibióticos.

Líneas de Investigación

Mecanismo de transducción de señal de las proteínas BlaR1 y MecR1 de los sistemas de resistencia a β-lactámicos de Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus es la principal causa de infecciones intra- y extra-hospitalarias en el mundo. Estudios epidemiológicos recientes demuestran la emergencia de clones con alta virulencia asociados a infecciones invasivas tanto en la comunidad como en el hospital en la región central de la Argentina. Existe gran preocupación por la creciente prevalencia de infecciones causadas por cepas de S. aureus resistentes a la acción de los antibióticos β-lactámicos (MRSA, S. aureus meticilino-resistente). Los mecanismos de resistencia a los antibióticos β-lactámicos en S. aureus se activan solo cuando la bacteria se encuentra en presencia de un β-lactámico. Esta activación está regulada por las proteínas transmembrana sensoras/transductoras de señales BlaR1 y MecR1. La resistencia a antibióticos β -lactámicos se debe a la expresión inducible de dos enzimas: la serin-β-lactamasa PC1 y la transpeptidasa PBP2a, no inhibida por concentraciones clínicas de la mayoría de estos antibióticos. Los genes que codifican estas enzimas en MRSA (blaZ y mecA, respectivamente) están codificados en dos operones (bla y mec, respectivamente), que incluyen los genes que codifican para las proteínas BlaR1 y MecR1. Ni el dominio transmembrana/metaloproteasa, ni las proteínas completas MecR1 y BlaR1, son aislables hasta el momento para el estudio de sus estructura y mecanismo. Recientemente, publicamos un modelo para MecR1 completa basado en modelos de homología, datos de coevolución de residuos, un nuevo mapeo experimental extenso de topología transmembrana, estructuras parciales, simulaciones moleculares y datos de RMN disponibles. Este estudio proporciona el primer modelo coherente de la estructura de MecR1 en su forma inactiva, y nos permitió proponer un mecanismo para la transducción de señal. En nuestro grupo intentamos caracterizar los cambios conformacionales que llevan a la activación de BlaR1 y MecR1 en respuesta a los β-lactámicos, empleando compuestos fotoactivables, mutagénesis, cepas reporteras, cristalografía de rayos X, entre otras técnicas.  El rol de las proteínas BlaR1 y MecR1 en la inducción de la resistencia a β-lactámicos las convierte en excelentes blancos para el diseño de compuestos inhibidores que permitan restablecer la eficacia de los antibióticos β-lactámicos para el tratamiento de infecciones causadas por MRSA. En colaboración con investigadores del IQUIR e IBR, trabajamos en la búsqueda de inhibidores de estos sistemas.

Detalles moleculares del reconocimiento de antibióticos β-lactámicos y glicopéptidos por las proteínas sensoras del sistema VraSRT de S. aureus

El glicopéptido vancomicina es el antibiótico disponible para el tratamiento de infecciones por MRSA. El panorama no es sin embargo alentador, dado que algunas cepas de S. aureus también han desarrollado mecanismos de resistencia a vancomicina. El sistema de tres componentes VraSRT, coordina la respuesta a antibióticos que inhiben la biosíntesis del peptidoglicano de la pared celular en S. aureus y está asociado a la resistencia a antibióticos glicopéptidos y β -lactámicos. La inactivación de este sistema afecta drásticamente la resistencia de diferentes cepas de S. aureus a vancomicina (un glicopéptido) y también a antibióticos β-lactámicos. Se desconoce la señal que dispara la activación de la proteína sensora/quinasa VraS y el rol de la proteína de membrana VraT. Estudios preliminares del grupo, empleando ampicilina modificada con compuestos fotoactivables indicaron la formación de aductos covalentes entre VraS y las fotosondas, lo cual sugiere que la activación del sistema VraSRT se debería a una interacción directa del antibiótico β-lactámico con la quinasa VraS. Estamos abocados a la caracterización de los aductos VraS-fotosonda, y a evaluar el rol de VraT en la activación del sistema. Además, estamos trabajando en la caracterización de compuestos producidos por Actinomicetes, que inhiben la activación del sistema VraSRT en respuesta a los antibióticos β-lactámicos y glicopéptidos.

Reconocimiento de antibióticos β-lactámicos por el sistema de resistencia VbrK/VbrR del Vibrio parahaemolyticus

El surgimiento de bacterias resistentes a antibióticos β-lactámicos es un problema de salud pública a nivel mundial. Cepas resistentes del género Vibrio (causantes de infecciones intestinales agudas) han sido reportadas alrededor de todo el planeta, constituyendo una amenaza especialmente en países en desarrollo. Recientemente se ha descripto un nuevo sistema sensor directo de antibióticos β-lactámicos que activa la producción de β-lactamasa en Vibrio parahaemolyticus. Se trata de un sistema de dos componentes denominados VbrK/VbrR. Este sistema se encuentra principalmente en bacterias del género Vibrio, convirtiéndolo en un blanco específico para el tratamiento de infecciones causadas por especies de este género. Nuestro objetivo es la comprensión del mecanismo molecular de activación de la resistencia por VbrK/VbrR. Empleando técnicas biofísicas apuntamos a caracterizar la afinidad del receptor por distintos antibióticos, determinar su estructura por cristalografía de rayos X en presencia y ausencia del antibiótico, determinar su estado oligomérico, y generar un sistema de mapeo de interacciones por RMN. Esta información proveerá las bases para el diseño racional de drogas contra estas infecciones.

Publicaciones Seleccionadas

  • Belluzo, B.S.; Abriata, L.A.; Giannini, E. †; Mihovilcevic, D.; Dal Peraro, M.; Llarrull, L.I.*; equally contributing authors, *corresponding author; “An experiment-informed signal transduction model for the role of the Staphylococcus aureus MecR1 protein in β-lactam resistance”, Scientific Reports, 2019, 9(1), 19558.
  • Boudreau, M.A. Fishovitz, J. Llarrull, L.I. Xiao, Q. Mobashery, S.(2015) Phosphorylation of BlaR1 in Manifestation of Antibiotic Resistance in Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus and Its Abrogation by Small Molecules, ACS Infectious Diseases. 1(10), 454-459.
  • Blázquez B, Llarrull LI, Luque-Ortega JR, Alfonso C, Boggess B, Mobashery S, equally contributing authors. (2014) Regulation of Expression of the b-Lactam Antibiotic-Resistance Determinants in Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Biochemistry, 53:1548-1550.
  • O’Daniel, P.I. Peng, Z. Pi, H. Testero, S. A. Ding, D. Spink, E. Leemans, E. Boudreau, M. A. Yamaguchi, T. Schroeder, V. A. Wolter, W. R. Llarrull, L. I. Song, W. Lastochkin, E. Kumarasiri, M. Antunes, N. T. Espahbodi, M. Lichtenwalter, K. Suckow, M. A. Vakulenko, S. Mobashery, S. Chang, M. (2014) Discovery of a New Class of Non-β-Lactam Inhibitors of Penicillin-binding Proteins with Gram-positive Antibacterial Activity”. Journal of the American Chemical Society, 136:3664-3672.
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  • Kumarasiri, M. Llarrull, L.I. Borbulevych, O. Fishovitz, J. Lastochkin, E. Baker, B. M. Mobashery, S. (2012) An Amino-Acid Position at the Crossroads of Evolution of Protein Function: Antibiotic-Sensor Domain of the BlaR1 Protein from Staphylococcus aureus vs. Class D β –Lactamases; equally contributing authors. Journal of Biological Chemistry, 287(11):8232-41.
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  • Llarrull, L.I. Fisher, J.F. Mobashery, S. (2009) Molecular basis and phenotype of methicillin resistance in Staphylococcus aureus and insights into new beta-lactams that meet the challenge. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 53(10): 4051-4063. Review Article

 

Colaboradores

  • Sebastián Testero (IQUIR, Rosario, Argentina)
  • Hugo Gramajo y Eduardo Rodriguez (IBR, Rosario, Argentina)
  • Shahriar Mobashery (University of Notre Dame, Notre Dame, IN, USA)
  • Juan Hermoso (Departamento de Cristalografía y Biología Estructural, Inst. Química-Física "Rocasolano", CSIC, Madrid, España)
  • Matteo Dal Peraro, Luciano Abriata (École Polytechnique Fédérale de Lausanne, Lausana, Suiza)

 

Subsidios

  • PICT-2018-03362, Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, Investigador Responsable: Leticia Llarrull
  • PICT-2018-03720, Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, Investigador Responsable: Irina Suarez
  • Subsidio para Proyectos de Unidades Ejecutoras, CONICET PIP 22920160100039CO; Tema de InvestigaciónEstrategias bioguiadas para la búsqueda de co-drogas para el tratamiento de infecciones causadas por cepas resistentes a Staphylococcus aureus (BD20160165CO; Investigador Responsable: Leticia Llarrull).
  • PID 8070, Instruct-ERIC (2019)

 

Director

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Llarrull, Leticia
Sede CCT
Email: llarrull@ibr-conicet.gov.ar
Oficina Int: 638
Laboratorio Int: 625

Investigadores

Suarez, Irina

Becarios Doctorales

Antinori, Melisa

Fabbri Carolina

Mihovilcevic, Damila