Sensores bacterianos

Resumen

La investigación que llevamos a cabo se inserta en un área prioritaria: el estudio de los mecanismos de resistencia a antibióticos y el desarrollo de estrategias para contrarrestarlos. El rápido desarrollo de resistencia a los antibióticos representa un gran desafío para la prevención y el tratamiento de infecciones bacterianas. Es crítico poder identificar nuevos compuestos activos contra cepas resistentes o que reestablezcan la sensibilidad de las mismas a los antibióticos actualmente disponibles. En nuestro grupo estudiamos sistemas inducibles por antibióticos de bacterias patógenas. Específicamente, abordamos la caracterización funcional y estructural de proteínas de membrana que detectan la presencia de antibióticos y activan la expresión de genes de resistencia. A su vez, trabajamos para identificar inhibidores de estas proteínas de membrana, que permitan restablecer la eficacia de los antibióticos β-lactámicos y/o glicopéptidos para el tratamiento de infecciones.

Líneas de Investigación

Mecanismo de transducción de señal de las proteínas BlaR1 y MecR1 de Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus es la principal causa de infecciones intra- y extra-hospitalarias en el mundo. Existe gran preocupación por la creciente prevalencia de infecciones causadas por cepas de S. aureus resistentes a la acción de los antibióticos β-lactámicos (MRSA, S. aureus meticilino-resistente). Los mecanismos de resistencia a los antibióticos β-lactámicos en S. aureus se activan solo cuando la bacteria se encuentra en presencia de un β-lactámico. Esta activación está regulada por las proteínas transmembrana sensoras/transductoras de señales BlaR1 y MecR1. MecR1 regula la expresión de la transpeptidasa PBP2a, no inhibida por concentraciones clínicas de la mayoría de estos antibióticos. En tanto que BlaR1 regula la expresión de la serin-β-lactamasa PC1 y, en algunas cepas, de PBP2a. Nuestro grupo está abocado a caracterizar estructuralmente a MecR1 y BlaR1, para comprender los cambios conformacionales que llevan a la activación de estas metaloproteasas por β-lactámicos. Para esto combinamos ensayos microbiológicos (cepas reporteras), bioquímicos (ensayos de actividad, entrecruzamiento químico con compuestos fotoactivables, entre otros) y biofísicos (crio-microscopía electrónica, dicroísmo circular, espectroscopía de Resonancia Paramagnética Electrónica (en colaboración con el Dr. Tabares, I2BC, Francia) y Transferencia de Energía por Resonancia de Luminiscencia, entre otras técnicas).

Detalles moleculares del reconocimiento de antibióticos β-lactámicos y glicopéptidos por las proteínas sensoras del sistema VraSRT de Staphylococcus aureus

El glicopéptido vancomicina es el antibiótico disponible para el tratamiento de infecciones por MRSA. El panorama no es sin embargo alentador, dado que algunas cepas de S. aureus también han desarrollado mecanismos de resistencia a vancomicina. El sistema de tres componentes VraSRT, coordina la respuesta a antibióticos que inhiben la biosíntesis del peptidoglicano de la pared celular en S. aureus y está asociado a la resistencia a antibióticos glicopéptidos y β-lactámicos. La inactivación de este sistema afecta drásticamente la resistencia de diferentes cepas de S. aureus a vancomicina y también a antibióticos β-lactámicos. Se desconoce la señal que dispara la activación de la proteína sensora/quinasa VraS y el rol de la proteína de membrana VraT. Empleando fotosondas derivadas de antibióticos, cepas reporteras y ensayos de actividad quinasa/fosfotransferasa, estamos evaluando si la activación se debe a la interacción directa con los antibióticos. Además, abordamos la caracterización estructural de los cambios conformacionales que dan lugar a la activación, empleando crio-microscopía electrónica, dicroísmo circular, espectroscopía de Resonancia Paramagnética Electrónica (en colaboración con el Dr. Tabares, I2BC, Francia) y Transferencia de Energía por Resonancia de Luminiscencia, entre otras técnicas.

Reconocimiento de antibióticos β-lactámicos por el sistema de resistencia VbrKR de Vibrio parahaemolyticus

El surgimiento de bacterias resistentes a antibióticos β-lactámicos es un problema de salud pública a nivel mundial. Cepas resistentes del género Vibrio (causantes de infecciones intestinales agudas) han sido reportadas alrededor de todo el planeta, constituyendo una amenaza especialmente en países en desarrollo. Recientemente se ha descripto un nuevo sistema sensor directo de antibióticos β-lactámicos que activa la producción de β-lactamasa en Vibrio parahaemolyticus. Se trata de un sistema de dos componentes denominado VbrKR. Este sistema se encuentra principalmente en bacterias del género Vibrio, convirtiéndolo en un blanco específico para el tratamiento de infecciones causadas por especies de este género. Nuestro objetivo es la comprensión del mecanismo molecular de activación de VbrKR. Empleando técnicas biofísicas apuntamos a caracterizar la afinidad del receptor por distintos antibióticos, determinar su estructura por cristalografía de rayos X en presencia y ausencia del antibiótico, determinar su estado oligomérico, y generar un sistema de mapeo de interacciones por RMN. Esta información proveerá las bases para el diseño racional de drogas para tratar estas infecciones.

Identificación de inhibidores de los sensores de antibióticos β-lactámicos en Staphylococcus aureus

La resistencia a antibióticos β-lactámicos y glicopéptidos en S. aureus se debe a la expresión inducible de diferentes determinantes de resistencia. S. aureus cuenta con proteínas de membrana que son sensores de estos antibióticos. Las proteínas sensoras pueden ser metaloproteasas (como es el caso de las proteínas BlaR1 y MecR1) o quinasas de sistemas de dos/tres componentes (como es el caso de la proteína VraS). La interacción con el antibiótico desata un mecanismo de transducción de señal que lleva a la activación del dominio citoplasmático de estas proteínas (dominio catalítico), dando lugar a una cascada de reacciones en el citoplasma que culmina en la expresión de los determinantes de resistencia. En colaboración con el Dr. Rodriguez (IBR) y el Dr. Testero (IQUIR) trabajamos para identificar compuestos capaces de inhibir la activación de estos sistemas de resistencia y caracterizar su mecanismo de inhibición. El hallazgo de compuestos inhibidores proveería de información clave para comprender el mecanismo de transducción de señal. Además, estos inhibidores permitirían el diseño de terapias combinadas con β-lactámicos/glicopéptidos para el tratamiento de infecciones con cepas resistentes.

Publicaciones Seleccionadas

  • Medicinal Chemistry of β-Lactam Antibiotics. Burger's Medicinal Chemistry, Drug Discovery and Development, Eight Edition. Vol. 7 (Antiinfectives), Abraham, D. J. and Myers, M. (Eds.), John Wiley and Sons, pp 1-188. Testero, S.A.; Llarrull, L.I.; Fisher, J.F.; Mobashery, S. (2021). https://doi.org/10.1002/0471266949.bmc226.pub2
  • An experiment-informed signal transduction model for the role of the Staphylococcus aureus MecR1 protein in β-lactam resistance. Scientific Reports. 9(1), 19558. Belluzo, B.S.; Abriata, L.A.; Giannini, E.; Mihovilcevic, D.; Dal Peraro, M.; Llarrull, L.I.* (2019). https://doi.org/10.1038/s41598-019-55923-z
  • Discovery of a New Class of Non-β-Lactam Inhibitors of Penicillin-binding Proteins with Gram-positive Antibacterial Activity. Journal of the American Chemical Society. 136:3664-3672. O’Daniel, P.I. Peng, Z. Pi, H. Testero, S. A. Ding, D. Spink, E. Leemans, E. Boudreau, M. A. Yamaguchi, T. Schroeder, V. A. Wolter, W. R. Llarrull, L. I. Song, W. Lastochkin, E. Kumarasiri, M. Antunes, N. T. Espahbodi, M. Lichtenwalter, K. Suckow, M. A. Vakulenko, S. Mobashery, S. Chang, M. (2014). https://doi.org/10.1021/ja500053x
  • How Allosteric Control of Staphylococcus aureus Penicillin-Binding Protein 2a Enables Methicillin-Resistance and Physiological Function. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 10 (42):16808-16813. Otero LH, Rojas-Altuve A, Llarrull LI, Carrasco-López C, Kumarasiri M, Lastochkin E, Fishovitz J, Dawley M, Hesek D, Lee M, Johnson JW, Fisher JF, Chang M, Mobashery S, Hermoso JA. (2013).  https://doi.org/10.1073/pnas.1300118110
  • Dissection of Events in the Resistance to β-Lactam Antibiotics Mediated by the Protein BlaR1 from Staphylococcus aureus. Biochemistry. 51:4642-4649. Llarrull LI, Mobashery S. (2012). https://doi.org/10.1021/bi300429p
  • An Amino-Acid Position at the Crossroads of Evolution of Protein Function: Antibiotic-Sensor Domain of the BlaR1 Protein from Staphylococcus aureus vs. Class D β –Lactamases. Journal of Biological Chemistry. 287(11):8232-41. Kumarasiri, M.*: Llarrull, L.I.*; Borbulevych, O.: Fishovitz, J.: Lastochkin, E.: Baker, B. M.: Mobashery, S.; *equally contributing authors (2012). https://doi.org/10.1074/jbc.M111.333179
  • Activation of BlaR1 Protein of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, Its Proteolytic Processing and Recovery from Induction of Resistance. Journal of Biological Chemistry, 286(44):38148-38158. Llarrull, L.I., Toth, M., Champion, M.M., Mobashery, S. (2011). https://doi.org/10.1074/jbc.M111.288985

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