Unidad de Cristalografía de Proteínas

Resumen

En nuestra unidad empleamos la cristalografía de proteínas por difracción de rayos X para estudiar la estructura tridimensional de componentes esenciales de la materia viva, a fin de arribar a una comprensión a resolución atómica de la arquitectura y los mecanismos moleculares de la vida. En particular, nos interesamos por el estudio de las bases estructurales de la actividad de proteínas relevantes para el fitness bacteriano, con foco en sistemas de transducción de señales en bacterias patógenas. Estos sistemas evolucionaron para mediar la adaptación de la fisiología bacteriana al entorno en el hospedador y la sobrevida frente a la reacción del sistema inmune. Entones, nos proponemos estudiar cómo y en qué medida las interfaces proteína:proteína (co)evolucionan para mediar el flujo de información en bacterias y servir como fuerza motriz en la evolución de la vida. En nuestros estudios empleamos enfoques interdisciplinarios, integrando la biología estructural, la bioquímica y la biofísica de proteínas, junto con abordajes computacionales y ensayos en in vivo.

Líneas de Investigación

Transducción de señales por O-fosforilación en Mycobacteria

La fosforilación reversible de proteínas ha evolucionado como un mecanismo ubicuo para la regulación de procesos biológicos en todos los reinos de la vida. Si bien la fosforilación de residuos de Ser/Thr/Tyr puede alterar directamente la función bioquímica de una proteína, más a menudo crea sitios de anclaje para proteínas que se unen a fosfo-sitios, estableciéndose módulos tripartitos compuestos por proteínas quinasas escritoras, proteínas fosfatasas que borran y dominios de unión a fosfo-sitios lectores de la modificación post-traduccional. Nuestra línea de investigación principal aborda los mecanismos moleculares en la vía de transducción de señales por la quinasa de proteínas en Ser/Thr PknG, que monitorea la disponibilidad de aminoácidos para controlar el metabolismo y la virulencia en Mycobacterium tuberculosis, el agente causal de la tuberculosis en humanos. En presencia del estímulo, PknG se auto-fosforila en residuos de Thr y recluta al sustrato GarA, un regulador que posee un dominio FHA (forkhead associated) C-terminal, con alta afinidad por residuos p-Thr. En su estado no fosforilado GarA regula por interacción directa tres enzimas metabólicas, lo que determina que el alfa-cetoglutarato, un intermediario metabólico clave, se desvíe del ciclo de Krebs (metabolismo de C) en favor de la síntesis de glutamato (metabolismo de N). Al ser fosforilado por PknG en su extensión N-terminal, GarA sufre un cambio conformacional debido al reconocimiento intramolecular del sitio de fosforilación por el dominio FHA C-terminal en la misma molécula. Esta interacción inhibe la acción de GarA, y el alfa-cetoglutarato es entonces direccionado al ciclo de Krebs. Si bien las interacciones proteína:proteína en la vía de señalización de PknG comenzaron a estudiarse hace más de una década, sólo recientemente empezamos a comprender las bases estructurales de la especificidad, la selectividad y la direccionalidad en este sistema. Por esto, nos proponemos profundizar el estudio de las interacciones entre componentes conocidos en esta vía de señalización así como nuevos miembros que se identifiquen. De modo muy interesante, estudios recientes llevados a cabo en colaboración con el grupo de la Dra. Rosario Durán (Institut Pasteur de Montevideo, Uruguay) señalan que la vía de señalización de PknG incluye componentes adicionales, vinculando el metabolismo bacteriano a la síntesis de la pared celular. Por otro lado, en colaboración con el grupo de la Dra. Andrea Villarino (Universidad de la República, Montevideo, Uruguay) nos proponemos estudiar las bases moleculares de la activad de la proteína fosfatasa de p-Tyr PtpA, que es secretada por M. tuberculosis al citosol de los macrófagos infectados, donde modifica, entre otros blancos, enzimas metabólicas, probablemente subvirtiendo el metabolismo del hospedero en favor de la sobrevida bacteriana. Este abordaje dual es interesante ya que permite establecer un correlato entre funciones bacterianas intra- y extra-celulares, con importantes implicancias en la interacción entre el patógeno y el hospedero infectado.

Se han dedicado importantes esfuerzos a elucidar la arquitectura de las vías de señalización involucrando quinasas y fosfatasas de proteínas en Ser/Thr/Tyr en bacterias y a comprender los mecanismos y sistemas moleculares asociados. Si bien resulta claro que la O-fosforilación es un proceso clave en la fisiología bacteriana, sólo recientemente se han comenzado a esclarecer los componentes de los sistemas involucrados y sus roles vincularlos a procesos biológicos específicos. Los datos disponibles sustentan la evolución de las quinasas y las fosfatasas en Ser/Thr/Tyr a partir de sendos ancestros comunes previo a la divergencia entre eucariotas y procariotas, por lo que es plausible que estas enzimas hayan evolucionado mecanismos distintivos asociados a la O-fosforilación en bacterias. Si bien desde los inicios de los estudios estructurales resultó evidente que sus arquitecturas moleculares, mecanismos catalíticos y propiedades bioquímicas eran similares a las contrapartes eucariotas, se han evidenciado particularidades únicas de los sistemas de O-fosforilación bacterianos a medida que se han identificado nuevos componentes y funciones involucrados. Nuestra hipótesis es que PknG y PtpA actúan como nodos claves en redes de señalización que dirigen adaptaciones de la fisiología bacteriana y median la supervivencia de M. tuberculosis en células infectadas, constituyendo excelentes puntos de ingreso para al estudio de interfaces proteína:proteína específicas con roles esenciales en la virulencia. Una comprensión profunda de estas vías de señalización permitirá descifrar cómo el bacilo de la tuberculosis coordina procesos fisiológicos esenciales y la virulencia en respuesta a estímulos externos. Además, esta información sustentará el diseño de estrategias originales para la intervención terapéutica contra la tuberculosis.

Publicaciones Seleccionadas

  1. Simpkin AJ, Simkovic F, Thomas JMH, Savko M, Lebedev A, Uski V, Ballard C, Wojdyr M, Wu R, Sanishvili R, Xu Y, Lisa MN, Buschiazzo A, Shepard W, Rigden DJ and Keegan R (2018). SIMBAD: A Sequence-independent molecular replacement pipeline. Acta Crystallographica Section D, en prensa.
  2. Lisa MN*, Palacios AR*, Aitha M, González MM, Moreno DM, Crowder MW, Spencer J, Tierney D, Llarrull LI and Vila AJ (2017). A General Reaction Mechanism for Carbapenem Hydrolysis by Mono- and Binuclear Metallo-beta-lactamases. Nature Communications, 8, 538.
  3. Rieck B, Degiacomi G, Zimmermann M, Cascioferro A, Boldrin F, Lazar-Adler NR, Bottrill AR, le Chevalier F, Frigui W, Bellinzoni M, Lisa MN, Alzari PM, Nguyen L, Brosch R, Sauer U, Manganelli R and O’Hare H (2017). PknG senses amino acid availability to control metabolism and virulence of Mycobacterium tuberculosis. Plos Pathogens, 13, e1006399.
  4. Lisa MN*, Wagner T*, Alexandre M, Barilone N, Raynal B,d, Alzari PM and Bellinzoni M (2017). The crystal structure of PknI from Mycobacterium tuberculosis shows an inactive, pseudokinase-like conformation. FEBS Journal 284, 602-614. *Equal contribution.
  5. Schulze JO, Saladino G, Busschots K, Neimanis S, Süß E, Odadzic D, Zeuzem S, Hindie V, Herbrand AK, Lisa MN, Alzari PM, Gervasio FL and Biondi RM (2016). Bidirectional Allosteric Communication between the ATP-Binding Site and the Regulatory PIF Pocket in PDK1 Protein Kinase. Cell Chem Biol. 23, 1193-1205.
  6. Coluccia A, La Regina G, Barilone N, Lisa MN, Brancale A, André-Leroux G, Alzari PM and Silvestri R (2016). Structure-based Virtual Screening to Get New Scaffold Inhibitors of the Ser/Thr Protein Kinase PknB from Mycobacterium tuberculosis. Lett Drug Des Discov. 13, 1012-1018.
  7. Morán-Barrio J*, Lisa MN*, Larrieux N, Drusin SI, Viale AM, Moreno DM, Buschiazzo A and Vila AJ (2016). Crystal Structure of the Metallo-β-Lactamase GOB in the Periplasmic Dizinc Form Reveals an Unusual Metal Site. Antimicrob Agents Chemother. 60, 6013-6022. *Equal contribution.
  8. Lisa MN, Gil M, André-Leroux G, Barilone N, Durán R, Biondi RM and Alzari PM (2015). Molecular Basis of the Activity and the Regulation of the Eukaryotic-like S/T Protein Kinase PknG from Mycobacterium tuberculosis. Structure. 23, 1039-1048.

Colaboradores

  • Andrea Villarino (Universidad de la República, Uurguay)
  • Rosario Durán (Institut Pasteur de Montevideo, Uruguay)
  • Gwénaëlle André (Institut National de la Recherche Agronomique, Francia)
  • Gabriela Gago (IBR, Argentina)
  • Andrés Binolfi (IBR, Argentina)
  • Adrián Turjanski (FCEN-UBA, Argentina)
  • Pedro Alzari (Institut Pasteur, France)
  • Alejandro Buschiazzo (Institut Pasteur de Montevideo, Uruguay)
  • Eleonora García Véscovi (IBR, Argentina)
  • Leticia Llarrull (IBR, Argentina)
  • Susana Checa (IBR, Argentina)
  • Julia Cricco (IBR, Argentina)
  • Alejandro Vila (IBR, Argentina)
  • Clarisa Álvarez (CEFOBI, Argentina)
  • Marcos Tronconi (CEFOBI, Argentina)

Subsidios

  • CONICET – Beca de reinserción

Director

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Lisa, María Natalia
Sede CCT
Email: lisa@ibr-conicet.gov.ar
Tel: +54 341 4237070
Oficina Int: 732
Laboratorio Int: 624

Imágenes

Patrón de difracción de rayos X de cristales de PknG (izquierda), mapa de densidad electrónica 2Fo-Fc de la unidad asimétrica (centro), modelo cristalográfico PDB 4Y0X (derecha). Lisa MN et al, 2015, Structure.

Mapa de densidad electrónica 2Fo-Fc a 1,1 Å de resolución y el correspondiente modelo cristalográfico (PDB 4CJ0).