Cascadas de señalización celular

Resumen

Nuestro trabajo apunta al estudio multifactorial de parámetros fisiológicos celulares que ayuden a interpretar y comprender vías de señalización intracelular desde la óptica de la biología sistémica. Para alcanzar este objetivo, utilizamos distintas herramientas que permitan la lectura de múltiples factores intracelulares a la vez. Nuestro grupo utiliza al espermatozoide de ratón como principal célula modelo. Siendo el espermatozoide transcripcional y traduccionalmente inactivo, se presenta como un modelo excepcional para el estudio de mecanismos de señalización intracelular basados en modificación post-traduccionales. Sumado a esto, los estudios derivados de la investigación básica en espermatozoides de ratón posibilitan la extrapolación por un lado, al espermatozoide humano, de implicancia en la clínica reproductiva, y por otro, a especies de interés comercial como equinos y bovinos.

En los mamíferos, los espermatozoides no son fecundantes al momento de la  eyaculación. Estos adquieren esta capacidad dentro del tracto reproductor de la hembra en un proceso denominado capacitación. La capacitación en ratón puede lograrse en el laboratorio, mediante la incubación de espermatozoides durante tan sólo una hora en medios de cultivo definidos. El conocimiento actual indica que los cambios funcionales que conllevan a la capacitación no sólo no responden a una cascada lineal de eventos, sino que existe una combinación de procesos tanto simultáneos como secuenciales. Algunos de estos procesos ocurren tan pronto los espermatozoides son liberados del epidídimo, mientras que otros cambios ocurren más lentamente siendo disparados sólo luego de cierto período en condiciones que promueven la capacidad fecundante del espermatozoide. A nivel biológico, la capacitación espermática se asocia tanto con un cambio en el batido flagelar denominado hiperactivación, como con la habilidad del espermatozoide para desencadenar el proceso denominado exocytosis acrosomal ante un  agonista fisiológico.

La Proteina Kinasa PKA (PKA) cumple un rol fundamental, tanto en los eventos rápidos como lentos asociados a la capacitación. Entre estos eventos, se encuentran: 1) la hiperpolarización de la membrana plasmática del espermatozoide; 2) El aumento citoplasmático de la concentración de Ca2+; 3) La activación de Tyr kinasas; 4) Tanto la  inactivación como la activación de distintas Thr/Ser fosfatasas; 5) Modificación de la constitución lipídica de la membrana plasmática; 6) Polimerización de actina.  Con estos eventos en mente, surge que el espermatozoide se presenta como un excelente modelo para el estudio de cascadas de señalización, considerando los procesos que son desencadenados en el lapso de una hora, sumado a la facilidad de obtención de las muestras.

Nuestro laboratorio está actualmente enfocado en comprender los mecanismos por los cuales se regula la actividad de PKA durante la capacitación, y desencadena la hiperpolarización de la membrana plasmática. Esta hiperpolarización, al igual que en otros tipos celulares, es clave para habilitar procesos siguientes, como la exocytosis acrosomal en el espermatozoide. Los mecanismos por los cuales PKA promueve la hiperpolarización no son completamente conocidos. Sumado a esto, la pregunta que aun persiste es que,  siendo PKA activada al minuto de exposición en medio capacitante y coincidente con el aumento de cAMP derivado de sAC, por qué demora 30 min en desencadenarse el cambio de potencial? Esta pregunta es extensiva a una serie de eventos, que siendo comandados por PKA, demoran más tiempo en producirse, como la polimerización de actina y la activación de Tyr-kinasas como Src. Nuestro grupo identificó que PKA promueve la activación de Src, permitiendo luego su plena activación mediante fosforilación de Src-Tyr416. A su vez, mediante expresión heteróloga de Slo3 en ovocitos de Xenopus, vimos que Src es fundamental para la sensibilización del canal BK de K+ Slo3, responsable de la hiperpolarización de Em. Los resultados provenientes de estos trabajos ayudarán a la comprensión de la regulación de estos eventos en diferentes tipos celulares, como por ejemplo, en la regulación de Src en distintos tipos de cáncer.

Nuestro objetivo es la comprensión de la regulación de diversas cascadas de señalización (ver modelo de trabajo en Figura), que siendo disparadas por mismos mecanismos, son controladas tanto temporal como espacialmente de manera disímil en sistemas celulares. Nuestro grupo, conformado por una red de colaboradores, integra distintas técnicas, acoplando el análisis de parámetros fisiológicos derivados de estudios en célula única como citometría de flujo y microscopía de super-resolución,  con mediciones poblacionales como fluorimetría de células en suspensión y espectrometría de masa.

Publicaciones Seleccionadas

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Roy J, Kim B, Hill E, Visconti P, Krapf D, Vinegoni C, Weissleder R, Brown D, Breton S. “Tyrosine kinase-mediated axial motility of basal cells revealed by intravital imaging.” Nature Communications (2016) Feb 12;7:10666. doi: 10.1038/ncomms10666.

Cintia Stival, Florenza La Spina, Carolina Baró Graf, Enid Arcelay, Silvia E Arranz, Juan J Ferreira, Sylvie Le Grand, Viktor A Dzikunu, Celia M Santi, Pablo E Visconti, Mariano G Buffone, Dario Krapf. “Src Kinase Is the Connecting Player between Protein Kinase A (PKA) Activation and Hyperpolarization through SLO3 Potassium Channel Regulation in Mouse Sperm.” Journal of Biological Chemistry (2015)  Jul 24;290(30):18855-64

Romarowski A, Battistone MA, La Spina FA, Puga Molina LD, Luque GM, Vitale AM, Cuasnicu PS, Visconti PE, Krapf D, Buffone MG. “PKA-dependent phosphorylation of LIMK1 and Cofilin is essential for mouse sperm acrosomal exocytosis.”Developmental Biology (2015) Jul 10. pii: S0012-1606(15)30046-4.

Felipe A Navarrete, Francisco A García‐Vázquez, Antonio Alvau, Jessica Escoffier, Dario Krapf, Claudia Sánchez‐Cárdenas, Ana M Salicioni, Alberto Darszon, Pablo E Visconti. “Biphasic Role of Calcium in Mouse Sperm Capacitation Signaling Pathways”Journal of cellular Physiology  (2015) 230(8):1758-69

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D Krapf, E Arcelay, E V Wertheimer, A Sanjay, S H Pilder, A M Salicioni and P E Visconti. “Inhibition of ser/thr phosphatases induces capacitation-associated signaling in the presence of Src kinase inhibitors” Journal of Biological Chemistry (2010) 12;285(11):7977-85 .

C Stival, L del Puga Molina, B Paudel, MG Buffone, PE Visconti PE, D Krapf. “Sperm Capacitation and Acrosome Reaction in Mammalian Sperm.” Advances in Anatomy, Embryology and Cell Biology (2016) 220:93-106

Colaboradores

Dr Mariano G Buffone. Instituto de Biología y Medicina Experimental (CONICET), Buenos Aires, Argentina

Dr Pablo E. Visconti. Department of Veterinaty and Animal Sciences, University of Massachusetts. Amherst, MA, EEUU

Dr Diego Krapf.  School Of Biomedical Engineering, Colorado State University, CO, EEUU

Dra Silvia E Arranz. Plataforma de Biotecnología Acuatica. IBR, Rosario, Argentina

Dr Matias Zurbriggen. Institute of Mathematics and Natural Sciences

University of Düsseldorf, Alemania

Subsidios

Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT).

Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET).

Director

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Dario Krapf
Sede CCT
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Tel: +54 341 4237070
Oficina Int: 648
Laboratorio Int: 614

Becarios Post-Doctorales

Carla Ritagliati

Becarios Doctorales

Cintia Stival

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