Cascadas de señalización celular

Resumen

Nuestro trabajo apunta al estudio multifactorial de parámetros fisiológicos celulares que ayuden a interpretar y comprender vías de señalización intracelular desde la óptica de la biología sistémica. Para alcanzar este objetivo, utilizamos distintas herramientas que permitan la lectura de múltiples factores intracelulares a la vez. Nuestro grupo utiliza al espermatozoide de ratón como principal célula modelo. Siendo el espermatozoide transcripcional y traduccionalmente inactivo, se presenta como un modelo excepcional para el estudio de mecanismos de señalización intracelular basados en modificación post-traduccionales. Sumado a esto, los estudios derivados de la investigación básica en espermatozoides de ratón posibilitan la extrapolación por un lado, al espermatozoide humano, de implicancia en la clínica reproductiva, y por otro, a especies de interés comercial como equinos y bovinos.

En los mamíferos, los espermatozoides no son fecundantes al momento de la  eyaculación. Estos adquieren esta capacidad dentro del tracto reproductor de la hembra en un proceso denominado capacitación. La capacitación en ratón puede lograrse en el laboratorio, mediante la incubación de espermatozoides durante tan sólo una hora en medios de cultivo definidos. El conocimiento actual indica que los cambios funcionales que conllevan a la capacitación no sólo no responden a una cascada lineal de eventos, sino que existe una combinación de procesos tanto simultáneos como secuenciales. Algunos de estos procesos ocurren tan pronto los espermatozoides son liberados del epidídimo, mientras que otros cambios ocurren más lentamente siendo disparados sólo luego de cierto período en condiciones que promueven la capacidad fecundante del espermatozoide. A nivel biológico, la capacitación espermática se asocia tanto con un cambio en el batido flagelar denominado hiperactivación, como con la habilidad del espermatozoide para desencadenar el proceso denominado exocytosis acrosomal ante un  agonista fisiológico.

La Proteina Kinasa PKA (PKA) cumple un rol fundamental, tanto en los eventos rápidos como lentos asociados a la capacitación. Entre estos eventos, se encuentran: 1) la hiperpolarización de la membrana plasmática del espermatozoide; 2) El aumento citoplasmático de la concentración de Ca2+; 3) La activación de Tyr kinasas; 4) Tanto la  inactivación como la activación de distintas Thr/Ser fosfatasas; 5) Modificación de la constitución lipídica de la membrana plasmática; 6) Polimerización de actina.  Con estos eventos en mente, surge que el espermatozoide se presenta como un excelente modelo para el estudio de cascadas de señalización, considerando los procesos que son desencadenados en el lapso de una hora, sumado a la facilidad de obtención de las muestras.

Nuestro laboratorio está actualmente enfocado en comprender los mecanismos por los cuales se regula la actividad de PKA durante la capacitación, y desencadena la hiperpolarización de la membrana plasmática. Esta hiperpolarización, al igual que en otros tipos celulares, es clave para habilitar procesos siguientes, como la exocytosis acrosomal en el espermatozoide. Los mecanismos por los cuales PKA promueve la hiperpolarización no son completamente conocidos. Sumado a esto, la pregunta que aun persiste es que,  siendo PKA activada al minuto de exposición en medio capacitante y coincidente con el aumento de cAMP derivado de sAC, por qué demora 30 min en desencadenarse el cambio de potencial? Esta pregunta es extensiva a una serie de eventos, que siendo comandados por PKA, demoran más tiempo en producirse, como la polimerización de actina y la activación de Tyr-kinasas como Src. Nuestro grupo identificó que PKA promueve la activación de Src, permitiendo luego su plena activación mediante fosforilación de Src-Tyr416. A su vez, mediante expresión heteróloga de Slo3 en ovocitos de Xenopus, vimos que Src es fundamental para la sensibilización del canal BK de K+ Slo3, responsable de la hiperpolarización de Em. Los resultados provenientes de estos trabajos ayudarán a la comprensión de la regulación de estos eventos en diferentes tipos celulares, como por ejemplo, en la regulación de Src en distintos tipos de cáncer.

Nuestro objetivo es la comprensión de la regulación de diversas cascadas de señalización (ver modelo de trabajo en Figura), que siendo disparadas por mismos mecanismos, son controladas tanto temporal como espacialmente de manera disímil en sistemas celulares. Nuestro grupo, conformado por una red de colaboradores, integra distintas técnicas, acoplando el análisis de parámetros fisiológicos derivados de estudios en célula única como citometría de flujo y microscopía de super-resolución,  con mediciones poblacionales como fluorimetría de células en suspensión y espectrometría de masa.

Publicaciones Seleccionadas

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  • Disruption of protein kinase A localization induces acrosomal exocytosis in capacitated mouse sperm. J Biol Chem. 2018 Apr 26. pii: jbc.RA118.002286. Stival C, Ritagliati C, Xu X, Gervasi MG, Luque GM, Baro Graf C, Vega-Beltran JL, Torres NI, Darszon A, Krapf D, Buffone MG, Visconti P, Krapf Dario. doi: 10.1074/jbc.RA118.002286.
  • Regulation mechanisms and implications of sperm membrane hyperpolarization. Mech Dev. 2018 Apr 22. pii: S0925-4773(18)30032-7.Ritagliati C, Baro Graf C, Stival C, Krapf D.  doi: 10.1016/j.mod.2018.04.004.
  • Lysine acetylation modulates mouse sperm capacitation.
    Sci Rep. 2018 Sep 6;8(1):13334. Ritagliati C, Luque GM, Stival C, Baro Graf C, Buffone MG, Krapf D. doi: 10.1038/s41598-018-31557-5.
  • Transient exposure to calcium ionophore enables in vitro fertilization in sterile mouse models. Sci Rep. 2016 Sep 15;6:33589.Navarrete FA, Alvau A, Lee HC, Levin LR, Buck J, Leon PM, Santi CM, Krapf D, Mager J, Fissore RA, Salicioni AM, Darszon A, Visconti PE.  doi: 10.1038/srep33589.
  • Sperm Capacitation and Acrosome Reaction in Mammalian Sperm. Advances in Anatomy, Embryology and Cell Biology (2016) 220:93-106Cintia Stival, L del Puga Molina, B Paudel, MG Buffone, PE Visconti PE, Dario Krapf.
  • Mouse sperm begin to undergo acrosomal exocytosis in the upper isthmus of the oviduct. Developmental Biology (2016) Feb 10.La Spina FA, Puga Molina LC, Romarowski A, Vitale AM, Falzone TL, Krapf D, Hirohashi N, Buffone MG.
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  • Src Kinase Is the Connecting Player between Protein Kinase A (PKA) Activation and Hyperpolarization through SLO3 Potassium Channel Regulation in Mouse Sperm. Journal of Biological Chemistry (2015)  Jul 24;290(30):18855-64. Cintia Stival, Florenza La Spina, Carolina Baró Graf, Enid Arcelay, Silvia E Arranz, Juan J Ferreira, Sylvie Le Grand, Viktor A Dzikunu, Celia M Santi, Pablo E Visconti, Mariano G Buffone, Dario Krapf.
  • PKA-dependent phosphorylation of LIMK1 and Cofilin is essential for mouse sperm acrosomal exocytosis. Developmental Biology (2015) Jul 10. pii: S0012-1606(15)30046-4.Romarowski A, Battistone MA, La Spina FA, Puga Molina LD, Luque GM, Vitale AM, Cuasnicu PS, Visconti PE, Krapf D, Buffone MG.
  • Central role of soluble adenylyl cyclase and cAMP in sperm physiology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease (2014) 1842(12 Pt B):2610-20Mariano G Buffone, Eva V Wertheimer, Pablo E Visconti, Dario Krapf.
  • Compartmentalization of Distinct cAMP Signaling Pathways in Mammalian Sperm. Journal of Biological Chemistry (2013) 288(49); 35307–35320Wertheimer E, Krapf D, Vega-Beltran JL, Sánchez-Cárdenas C, Navarrete F, Haddad D, Escoffier J, Salicioni AM, Levin LR, Buck J, Mager J, Darszon A, Visconti PE.
  • Ca2+ ionophore A23187 can make mouse spermatozoa capable of fertilizing in vitro without activation of cAMP-dependent phosphorylation pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (2013) 110 (46), pp. 18543-18548 8Tateno H, Krapf D, Hino T, Sánchez-Cárdenas C, Darszon A, Yanagimachi R, Visconti PE.