Biología Estructural-Celular

Resumen

En nuestro grupo nos enfocamos en comprender como las propiedades fisicoquímicas y biológicas de las células modulan el comportamiento de proteínas. El entorno que rodea a una proteína en el interior celular difiere notoriamente de las condiciones de alta pureza y concentración que se usan normalmente para realizar estudios de biología estructural in vitro. En el ambiente altamente complejo de los espacios sub-celulares, la aglomeración macromolecular, los efectos de volumen excluido, la viscosidad, las interfases y las interacciones con metabolitos, lípidos, proteínas o ácidos nucleicos, modulan la estructura y actividad de proteínas. A su vez la composición y las propiedades fisicoquímicas de las células son dinámicas y cambian en respuesta a procesos biológicos como el ciclo celular o la presencia de distintos tipos de estrés. Por lo tanto, para entender el comportamiento de una dada proteína es necesario poder estudiarla con la mayor resolución posible in vivo. Actualmente, la única técnica que permite obtener este tipo de información con resolución atómica es el In-cell RMN.

La técnica de In-cell RMN se basa en la propiedad de que la mayoría de los heteronúcleos que se encuentran in vivo son invisibles para el espectrómetro de RMN. Por lo tanto, uno puede enriquecer una biomolécula determinada con átomos RMN-activos y observarla dentro de células vivas. Esencialmente, este proceso actúa como un filtro selectivo para la molécula a estudiar lo que permite su detección específica sobre el resto de la biomasa presente, no enriquecida. De esta forma, podemos caracterizar con resolución atómica distintos procesos biológicos, tales como interacciones, modificaciones post-traduccionales o reordenamientos estructurales que dan lugar a cambios de distintos paramétros de RMN, como por ejemplo la intensidad de señal o los desplazamientos químicos. Los mismos pueden cuantificarse in situ, de una manera no destructiva y resuelta en el tiempo.

Uno de los objetivos de nuestro trabajo es caracterizar in vivo las propiedades estructurales y la actividad de proteínas con actividad rédox involucradas en el desarrollo de enfermedades cardíacas y neuronales. Nos focalizamos en la familia de enzimas Metionina Sulfoxido Reductasas (MSR). Durante mucho tiempo se creyó que estas enzimas cumplían solamente un rol protector del daño oxidativo, pero evidencias recientes indican que tienen una función reguladora en procesos biológicos centrales como la división celular, la transmisión sináptica, o el funcionamiento del músculo cardíaco. Aplicamos técnicas de In-cell RMN para comprender cómo el ambiente intracelular modula las propiedades conformacionales de las MSRs, su especificidad de unión a sustrato y su actividad enzimática.

Publicaciones Seleccionadas

  1. Theillet F-X.*, Binolfi A.*, Bekei B.*., Martorana A., Rose H. M., Stuiver M., Verzini S., Lorenz D., van Rossum M., Goldfarb D., Selenko P. (2016) Structural disorder of monomeric α-synuclein persists in mammalian cells. Nature, 530, 45-50. *Igual contribución.

 

  1. Binolfi A., Limatola A., Verzini S., Kosten J., Theillet F-X., Rose H. M., Bekei B., Stuiver M., van Rossum M., Selenko P. (2016) Intracellular repair of oxidation-damaged alpha-synuclein fails to target C-terminal modification sites. Nature Communications, 7, 10251.

 

  1. Danielsson J., Mu X., Lang L., Wang H., Binolfi A., Theillet F-X., Bekei B., Logan D. T., Selenko P., Wennerström H., Oliveberg M. (2015) Thermodynamics of protein destabilization in live cells. Proceedings of the National Academic of Sciences U. S. A., 112, 12402-12407.

 

  1. Smith M. J., Marshall C. B., Theillet F-X., Binolfi A., Selenko P., Ikura M. (2015) Real-time NMR monitoring of biological activities in complex physiological environments. Current Opinion in Structural Biology, 32C, 39-47.

 

  1. Lombardo V.A.*, Otten C.*, Abdelilah-Seyfried S. (2015). Large-scale zebrafish embryonic heart dissection for transcriptional analysis. Journal of Visual Experiments, (95), e52087. * Igual contribución.

 

  1. Lombardo V.A.*, Dietrich A.*, Abdelilah-Seyfried S. (2014). Blood flow and Bmp control endocardial chamber morphogenesis. Developmental Cell, 30:367–377. *Igual contribución.

 

  1. Kosten J.*, Binolfi A.*, Stuiver M., Verzini S., Theillet F-X., Bekei B., van Rossum M., Selenko P. (2014) Efficient modification of alpha-synuclein serine 129 by protein kinase CK1 requires phosphorylation of tyrosine 125 as a priming event. ACS Chemical Neuroscience, 5, 1203-1208. *Igual contribución.

 

  1. Theillet F-X.*, Binolfi A.*, Frembgen-Kesner T., Hingorani K., Sarkar M., Kyne C., Li C., Crowley P., Gierasch L., Pielak G., Elcock A. H., Gershenson A., Selenko P. (2014) Physicochemical and biological properties of cells and their effects on IDPs. Chemical Reviews, 114, 6661-6714. *Igual contribución.

 

  1. Theillet F.-X., Rose H. M., Liokatis S., Binolfi A., Thongwichian R., Stuiver M., Selenko P. (2013) Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts. Nature Protocols, 8, 1416.

 

  1. Binolfi A., Theillet F-X., Selenko, P. (2012) Bacterial in-cell NMR of human a-synuclein: a disordered monomer by nature? Biochemical Society Transactions. 40, 950-954.

 

  1. Lombardo V.A., Sporbert A., Abdelilah-Seyfried S. (2012). Cell tracking using photoconvertible proteins during zebrafish development. Journal of Visual Experiments, (67), e4350.

Colaboradores

  • Alejandro J. Vila (IBR-CONICET, Rosario)
  • Bruno Manta Porteiro (Harvard Medical School, Boston)
  • Darío Krapf (IBR-CONICET, Rosario)
  • Diego de Mendoza (IBR-CONICET, Rosario)
  • Nora Calcaterra (IBR-CONICET, Rosario)
  • Pablo Armas (IBR-CONICET, Rosario)
  • Philipp Selenko (FMP, Berlin)

Director

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Andrés Binolfi
Sede CCT
Email: binolfi@ibr-conicet.gov.ar
Tel: +54 341 4237070
Oficina Int: 649
Laboratorio Int: 614

Investigadores

Dra. Verónica Lombardo

Tesinistas

Natalia Labadie

Imágenes

Interacciones entre una proteína y su entorno en el interior celular. Theillet, Binolfi and Bekei et al, Nature, 530, 45-50.

Microscopía confocal de un corazón de pez cebra.

Reducción de sulfóxidos de metionina en proteínas catalizada por MSRs celulares. Binolfi et al. Nat. Commun. 2016, 7, 10251.